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尾加压素Ⅱ在大鼠心肌纤维化发病机制中的作用及银杏叶提取物的干预研究

徐为民  
【摘要】:尾加压素II (urotensin II, UII)是已知体内活性最强的缩血管物质,除缩血管活性外,UII还是一种强烈的内源性丝裂原。近些来的一些研究表明UII与纤维化的发生密切相关,提示尾加压素Ⅱ在心肌纤维化(myocardialfibrosis,MF)过程中可能发挥重要作用。银杏叶提取物(ginkgobiobaextract,GBE)具有扩血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用,已被广泛应用于心、脑血管疾病的预防和治疗。研究表明GBE对肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化的预防有一定作用,但GBE对心肌纤维化的防治效果研究很少,且尚未见从细胞外基质(心肌中主要为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)积聚角度的研究。本研究的目的即探讨UII在心肌纤维化发生发展过程中的作用及可能机制,同时观察GBE的干预作用。 实验1(第2章),利用盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol hydrochloride,Iso)10mg/kg多点皮下注射复制大鼠心肌坏死模型。造模后的动物注射Iso12h后即出现点状坏死,随时间的延长缺血坏死面积明显增加,3周时已出现明显的纤维化。应用免疫组织化学及RT-PCR方法,对Iso所致MF发生发展过程中UII及GPR14基因和蛋白表达水平、转化生长因子β1、结缔组织生长因子进行了观察,部分大鼠给予银杏叶提取物GBE100mg/kg体重,观察其对纤维化的影响。结果表明:多点皮下注射Iso后12h UIImRNA及蛋白表达即增高,特别是mRNA,且这种增高明显早于纤维化的发生。尽管UII mRNA的表达于1周逐渐下降,但3周后仍未恢复到正常水平,而且UII蛋白表达水平仍然随着纤维化程度的加重稳步增高。GPR14mRNA和蛋白表达也表现为相同趋势,且这种增高明显早于纤维化的发生。UII、转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达也明显增高。而同时给予GBE的动物纤维化病变减轻,Masson染色蓝染纤维组织面积也减少,增高的UII、TGF-β1、CTGF的表达也明显降低。 实验2(第3章),体外培养心肌成纤维细胞,同时采用(angiotensinⅡ,AngII)及直接给予UII(10_(-8)mol/L)复制心肌纤维化细胞模型,检测细胞增殖、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF、TGF-β1的变化情况,同时观察UII抑制剂及GBE的干预作用。MTT结果显示GBE从6.25g·L_(-1)(6.25g·L_(-1)~50g·L_(-1))浓度起对可明显抑制AngⅡ引起的心肌成纤维细胞增殖,并呈明显的剂量依赖性。给予UII抑制剂SB657510(10_(-7)mol·L_(-1))细胞增殖情况明显缓解。 ELISA结果显示给予AngⅡ(10_(-7)mol·L_(-1))后心肌成纤维细胞上清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量增加。而给予不同浓度银杏叶提取物后,含量有所下降,特别是Ⅰ型胶原,1.56g·L_(-1)浓度组银杏叶提取物即可明显抑制其含量,并呈剂量依赖性。给予UII抑制剂SB657510(10_(-7)mol·L_(-1)),Ⅰ型胶原含量明显下降(P<0.05=。给予AngⅡ(10_(-7)mol·L_(-1))后心肌成纤维细胞上清TGF-β1、CTGF的含量均增加。给予UII抑制剂SB657510后,TGF-β1、CTGF含量均有降低趋势,特别是TGF-β1(P<0.05=具有明显的统计学意义。而银杏叶提取物从3.125g·L_(-1)浓度组开始对TGF-β1有抑制作用,6.25g·L_(-1)浓度组开始对CTGF有抑制作用。单纯给予UII仍然可引起心肌成纤维细胞增殖,不过程度弱于AngⅡ的促增殖作用。心肌成纤维细胞上清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量增加,而同时给予抑制剂的组别增殖情况、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量明显缓解。给予UII(10_(-8)mol·L_(-1))后,TGF-β1、CTGF的含量也增加。而GBE对UII(10_(-8)mol·L_(-1))诱导的增殖和胶原积聚均有抑制作用。从12.5g·L_(-1)浓度起可明显抑制UII诱导的心肌成纤维细胞增殖,3.125g·L_(-1)浓度组银杏叶提取物即可明显抑制Ⅰ型胶原含量,并呈剂量依赖性。同样,银杏叶提取物对UII引起的TGF-β1、CTGF含量增加也有抑制作用。 实验3(第4章),体外培养心肌成纤维细胞,并通过RNA干扰技术沉默TGF-β、CTGF的表达,观察基因沉默后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达情况。正常心肌细胞既有较高丰度的Ⅰ型胶原表达,给予UII后Ⅰ型胶原表达增强(P0.01),给予TGF-β1siRNA干扰后Ⅰ型胶原表达有所回落(P0.01),CTGF siRNA也降低Ⅰ型胶原蛋白表达(P0.05),但与TGF-βsiRNA比较,抑制程度弱一些。给予UII后Ⅲ型胶原的表达增强,TGF-βsiRNA干扰后表达下降(P0.05),CTGF siRNA干扰后有下降趋势,但无统计学意义。 结论: 1、尾加压素II及其受体GPR14参与大鼠心肌纤维化的发生发展过程。 2、银杏叶提取物可以缓解大鼠心肌纤维化程度,其机制与UII、TGF-β1、CTGF有关。 3、TGF-β1、CTGF、UII参与了AngⅡ对心肌成纤维细胞的致纤维化作用。 4、银杏叶提取物对AngⅡ诱导的ECM积聚的有改善作用。 5、UII做为一独立因素可引起心肌成纤维细胞增殖和细胞外基质积聚。 6、银杏叶提取物对UII诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原积聚及TGF-β1、CTGF高表达均有抑制作用。 7、UII诱导细胞外基质积聚由TGF-β1、CTGF介导。其中TGF-β1的作用要强于CTGF。 创新点 本研究首次利用RNA干扰技术探讨了UII致心肌纤维化的可能机制。UII在TGF-β1、CTGF介导下诱导心肌成纤维细胞增殖,胶原分泌增加,导致ECM积聚,进而发生心肌纤维化样病变。 首次从细胞外基质积聚角度观察了银杏叶提取物对坏死后心肌纤维化的改善作用及可能机制。银杏叶提取物可以抑制心肌纤维化的发生和发展,其机制可能与UII、TGF-β1、CTGF有关。银杏叶提取物临床应用广,老药新用防治心肌纤维化具有一定的优势。


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