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嗜热脱卤酶ST2570在乳酸生产中的应用

潘东  
【摘要】:脱卤酶是一类具有对含卤素有机物进行脱卤功能的酶,它们所作用的底物大多为具有稳定的碳-卤键卤代有机化合物。根据它们的底物特异性,将从环境中筛选得到的脱卤酶主要分为四大类,其中对L-2-卤代酸脱卤酶的研究较为透彻。ST2570来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii,属于L-2-卤代酸脱卤酶(L-2-HAD)超家族蛋白。ST2570具有分子立体选择性并催化L-2-卤代酸进行脱卤反应,而且ST2570参与的催化反应过程导致立体特异性的转变,使得L-2卤代烷酸转变为D-2-羟基烷酸,鉴于嗜热脱卤酶ST2570的高效催化活性、立体选择性以及嗜热酶所具有较高的热稳定性与较宽广的pH耐受范围(2~12),我们尝试将其应用于D型乳酸的生产。具体内容如下: 一、嗜热脱卤酶ST2570的表达与纯化:ST2570的基因片段构建于带有组氨酸标签的pET28b表达载体,重组ST2570在表达宿主E.coli BL21(DE3)pLysS中进行表达,并通过Ni-NTA层析纯化目的蛋白,最终得到电泳纯为90%以上的目的蛋白。 二、酶活检测以及反应产物与酶的底物立体选择性的明确:通过对ST2570酶学参数的检测,得到其比活力为2963.33U/mg,最适反应温度为70℃,最适反应pH为9.5,酶学特征参数的获得均为后续的催化反应条件的优化提供参考。本文的主要目的是利用ST2570进行特定的催化反应,以外消旋2-CPA为底物进行高纯度D型乳酸的生产,并利用反相HPLC对反应液中的2-CPA以及乳酸的变化进行检测,同时利用反相HPLC确定了ST2570对底物的立体选择性。 三、ST2570催化反应条件的优化:对以ST2570作为特定反应催化剂,外消旋2-CPA为底物进行乳酸生产的催化反应条件优化实验。由于乳酸属于热敏感物质,活性成分易受高温分解,所以最适反应温度降低至60℃,反应pH值稳定在9.5,因此优化过程主要从缓冲液浓度,底物浓度以及酶浓度三方面进行。在pH为9.5,温度为60℃,缓冲液浓度为3mol/L,初始底物浓度为0.5mol/L,初始酶浓度为30000U/L的条件下,反应36h,可达到最佳的反应状态。


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