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13株狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与遗传演化分析

齐瑛琳  
【摘要】:狂犬病是一种重要的人兽共患传染病,由狂犬病病毒(Rabies virus,RV或RABV)引起,几乎感染所有温血动物和人,发病后死亡率近100%。我国年报告狂犬病发病死亡人数仅次于印度,位居世界第二,严重威胁公民的生命安全,也给人民群众带来了极为沉重的心理上和经济上的负担。RABV宿主动物众多,使得病毒可在不同的宿主间转化,各种带毒动物又可导致RABV在不同地域间迁移。RABV分子流行病学是应用RT-PCR技术测定不同毒株的基因组序列,借助各种生物信息学软件进行比较和分析,从分子水平上研究RABV基因的变异与病毒毒力、抗原性、宿主特异性等之间的关系,进而确定毒株来源以及相互间的进化历程,系统掌握病毒种系发生及其变异规律,为制定正确的狂犬病防治策略、选择合适的动物及人用疫苗株提供理论基础。 本实验的研究对象为13株RABV街毒株,主要内容如下: 1、狂犬病病毒街毒株的分离鉴定 乳鼠脑内接种分离法及鼠成神经瘤细胞分离法对13种狂犬病阳性病料进行RABV的分离。使用直接免疫荧光技术及RT-PCR技术对接种后的脑组织及细胞进行鉴定。检测结果表明,本实验分离出13株RABV街毒株。 2、狂犬病病毒街毒株全基因测序与比较分析 设计RABV全基因组分段PCR扩增引物,对PCR产物进行克隆并测序,利用DNAStar和Clustalx等生物信息学软件进行序列拼接与编辑,分析全基因组的结构和组成,并对5个结构基因进行多重序列比对及同源性分析。测序获得13株RABV街毒株的全基因组核苷酸序列,基因组全长11921-11924nts,5个结构基因的ORF,长度分别为N基因1575nts、P基因894nts、M基因609nts、G基因1575nts、L基因6386nts,N-P-M-G-L间隔区序列长度分别为2nts、5nts、5nts、422nts,Leader结构和Trailer结构分别长50nts和70nts。本研究发现13株RABV街毒株其全基因组序列在结构及组成上均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征,结构基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性均高于核苷酸序列的同源性,GXQZD01、GDMMD57和HuNPB3这3株病毒间各结构基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,与其他10株病毒间则表现出相对较低的同源性,而这10株病毒相互间同源性较高。5个结构基因推导的氨基酸长度未变,在氨基酸序列上均在一定的变异,但结构蛋白的保守区和主要功能位点均未发生突变。 3、狂犬病病毒街毒株的遗传进化分析 利用MEGA等生物信息学软件对本研究中的13株RABV街毒株的结构基因及全基因组绘制遗传进化树,进行种系发生分析。结果显示,13株病毒均属于基因1型,与国外RABV的进化距离较远,具有较为独特的中国地域特点,因此本研究中13株病毒很有可能是存在于自然界中的固有街毒株。N基因进化树与全基因进化树基本上保持一致,基于其他不同基因构建的进化树大体相同。13株病毒中CDMMD57、GXQZD01和HuNPB3间亲缘关系较近,与国内鼬獾分离株共同处于较为独立的进化分支上,与泰国等地的人源街毒株进化距离较近。其他10株病毒间显示出较近的亲缘关系,与国内一些犬源RABV街毒株共处于相同的进化分支。


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