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孢子丝菌病的流行病学分析及T-DNA插入突变体的研究

燕巍  
【摘要】:孢子丝菌病是一种由申克孢子丝菌引起的皮肤真菌病,偶可播散至内脏引起全身播散型感染。对孢子丝菌病进行有效的防治,首先要明确其流行病学和病原学特点。我国孢子丝菌病多发生于东北地区,吉林省是孢子丝菌病的高发区。近年来,申克孢子丝菌引起的皮肤真菌病的发病率呈上升趋势,了解吉林省孢子丝菌病的流行病学特点对今后孢子丝菌病的预防和治疗具有重要意义。 从分子水平研究申克孢子丝菌的基因功能,有助于揭示其病原学特征和致病机制。利用分子标签获得突变体是进行基因功能研究的有效手段。根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术(ATMT)具有转化受体类别多、转化效率高、突变体遗传稳定、操作简单等优点而被广泛应用于丝状真菌基因功能的研究。 本研究将ATMT技术用于申克孢子丝菌的研究,优化了孢子悬液浓度、农杆菌的诱导时间以及共培养介质等影响转化效率的因素,提高了T-DNA的转化效率,建立了申克孢子丝菌T-DNA插入突变体库。通过筛选获得了一些表型明显变化的突变体,利用TAIL-PCR方法获得T-DNA插入侧翼序列,定位插入位点,进而分析突变体的基因功能。其中,突变体841是一株铜转运蛋白基因被打断的突变体,本研究推测铜转运蛋白基因参与调控申克孢子丝菌的生长和抗氧化应激的能力,并与申克孢子丝菌的致病力有关。 1.孢子丝菌病的流行病学分析 了解孢子丝菌病的流行病学特点,对于控制和预防孢子丝菌病的发生具有重要意义。本研究对208例孢子丝菌病患者进行了流行病学分析。结果表明,女性发病率较高,男女发病比率为1:1.51。发病年龄最小为3岁,最大为87岁,平均年龄为47岁,各年龄段均可感染该病。青壮年发病率最高(67.3%),其次是老年人(27.9%),未成年人发病率最低(12.5%)。农民占大多数(68.6%),且多有外伤史。固定型孢子丝菌病常见,其次是淋巴管型,播散型少见,仅有1例。发病部位以面部和上肢为主,固定型多发生在面部和上肢,淋巴管型多发生在上肢,播散型表现为全身感染。冬季发病率最高(37.5%),冬季为孢子丝菌病的高发季节。 2.根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化体系的优化及突变体的分析 本研究优化了影响根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化效率的关键因素,建立了稳定、高效的申克孢子丝菌转化体系:(1)诱导条件:根癌农杆菌的初始OD600nm为0.3,乙酰丁香酮浓度为200μM,诱导时间为6h;(2)共培养介质和条件:申克孢子丝菌孢子浓度为106个/ml,乙酰丁香酮浓度为200μM,孢子悬液和诱导6h的农杆菌以1:1混合,均匀涂布于含微孔滤膜的共培养基上,25℃培养48h;(3)筛选培养条件:25℃培养4天。在上述转化条件下,转化效率可达1000-1200个突变体/106个孢子。本研究获得了4500株突变体,初步建立了申克孢子丝菌的突变体库。T-DNA插入突变体的遗传稳定性高,可通过有丝分裂稳定遗传。从突变体库中筛选出7株表型变化明显的突变体,并成功扩增其T-DNA插入侧翼序列,利用生物信息学分析被打断基因的功能。 3.申克孢子丝菌铜转运蛋白基因功能研究 微量元素铜是微生物维持自身生长和发育不可缺少的重要条件。在多数蛋白质发挥功能时,铜担当着重要角色。本研究筛选出一株表型变化明显的突变体,通过TAIL-PCR方法获得了T-DNA插入侧翼序列。通过生物信息学分析,与稻瘟病菌、马尔尼菲青霉、黑曲霉、巴西副球孢子菌等真菌的铜转运蛋白基因同源性较高,命名为CTP基因。利用genebank数据库设计随机简并引物,本研究成功克隆出该基因片段,长度为1300bp。光学显微镜下可见突变体841的形态发生较大变化,菌丝较细,排列杂乱,分生孢子数量减少,易脱落。与野生型相比,突变体841生长速度无变化,但其酵母相的转化能力变弱,且对过氧化氢敏感,抗氧化应激能力下降。在小鼠系统性感染模型中,突变体841表现出较低的致病力。这些结果表明铜转运蛋白基因调控了申克孢子丝菌的生长和抗氧化应激的能力,并且与致病力相关。


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