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旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对宿主免疫细胞影响的初步研究

于建立  
【摘要】:旋毛虫病是由于人和动物生食或半生食含有旋毛虫感染性L1幼虫的肉或肉制品而引发的一种人兽共患病。本病致死率虽然不高(1-2%),仅重度感染才能造成严重的心肌及大脑损伤而导致死亡,但是在其肠道侵袭期通过免疫调控抑制宿主免疫力,同时干扰了各种细菌、病毒以及其他寄生虫疫苗的免疫预防效果,大大提高了其他病原体入侵宿主的可能性,对人类身体健康构成了巨大的威胁。但是目前对于这些旋毛虫调节宿主免疫反应的毒力分子不确定性及其作用机制尚不清楚导致了有关旋毛虫病的预防制剂的研发始终没有突破性的进展。本实验室通过构建了旋毛虫3日龄成虫cDNA文库,并利用免疫学筛选获得了高丰度和强抗原性的丝氨酸蛋白酶基因Zh68。寄生虫丝氨酸蛋白酶在宿主与寄生虫之间互相作用过程(如入侵宿主组织、寄生虫营养的摄取和逃避宿主免疫应答)中发挥了重要作用,甚至有研究表明丝氨酸蛋白酶可作为多种寄生虫感染性疾病的诊断标志。 本实验通过对旋毛虫成虫肠道感染期宿主多种免疫细胞的动态变化监测来初步剖析宿主免疫抑制的变化规律。首先将500条L1幼虫口服感染昆明小鼠,发现在感染后第1天小鼠肠道成虫回收率为65%,直至感染后第17天小鼠肠道成虫完全排出;感染后第5天到第9天是成虫稳定的肠道感染期,此时雌虫大量释放新生幼虫,并于第7天达到高峰。随后的流式细胞术检测结果显示感染后第7天CD4~+T淋巴细胞数量大量减少,同时T淋巴细胞对刀豆素A(Con A)的增殖性应答能力降低。本实验室在前期构建的新生幼虫cDNA文库中也筛选到了特异性丝氨酸蛋白酶基因T668,因此很有可能是成虫丝氨酸蛋白酶Zh68和新生幼虫特异性丝氨酸蛋白酶T668共同导致了这一结果的产生。在旋毛虫感染后的前7天,T淋巴细胞增多,以CD8~+T淋巴细胞为主,导致CD4~+/CD8~+比值下降,表明小鼠免疫力降低。从旋毛虫感染后第11天开始,CD4~+T细胞明显增多,小鼠免疫力逐步恢复。同时发现在旋毛虫肠道感染前期(感染前7天),小鼠巨噬细胞数量急剧下降,相对于LPS的刺激,B淋巴细胞对旋毛虫抗原无增殖性应答;从感染后第11天开始巨噬细胞数量恢复,B淋巴细胞数量开始上升。 鉴于旋毛虫肠道感染前期小鼠巨噬细胞急剧性变化,我们进一步通过体外实验研究旋毛虫成虫排泄分泌产物(ES产物)中的丝氨酸蛋白酶对巨噬细胞S774A.1的作用机制。CCK-8的实验结果表明成虫ES产物以剂量依赖性和时间依赖性的方式对S774A.1巨噬细胞产生毒性作用,但用抗成虫丝氨酸蛋白酶Zh68的抗体封闭ES产物之后,这一毒性作用大大减少;通过Annexin V/PI双标记流式细胞术检测结果表明成虫丝氨酸蛋白酶Zh68可以诱导巨噬细胞S774A.1凋亡。 目前有关旋毛虫免疫逃逸相关基因的研究薄弱,研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶在虫体侵袭及寄生过程中的功能及作用靶标、将为阐明旋毛虫侵袭过程中的免疫逃逸机制以及新型的抗旋毛虫及相关寄生虫药物研发打下结实基础。


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