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佐剂对HIV-1 gp120 DNA疫苗免疫效果的影响

狄静  
【摘要】:艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的一种传染性及病死率非常高的疾病,世界上每年大约有200多万人死于艾滋病,感染人群在全世界分布极为广泛。在研制的各种HIV疫苗中,普遍认为DNA疫苗是一种具有发展潜力的新型疫苗,因为它可被直接转染进机体细胞内并且表达抗原蛋白,这样减少了体外进行蛋白表达和纯化的过程;质粒DNA结构简单,提纯质粒工艺简便,适合大规模生产。虽然DNA疫苗存在很多优势,但是HIV DNA疫苗的临床试验还没有成功的例子,主要原因即为HIV DNA疫苗的免疫原性较差,如何提高DNA疫苗的免疫效果仍是亟待解决的问题。近年来,对DNA疫苗的研究实验结果表明,佐剂可以显著提高DNA疫苗在机体内的免疫原性,增强疫苗的免疫效果。在本课题中,我们用HIV-1gp120DNA疫苗与实验室现有的一些佐剂联合免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗gp120特异性IgG抗体水平,评价不同佐剂对HIV-1gp120DNA疫苗免疫效果的影响。 在本实验中所用的HIV-1gp120DNA疫苗为中国疾病控制中心(CDC)构建的两种质粒pENVPOL (简称EP)和pGAGTNR(简称GT),为高纯度质粒DNA,不能含有宿主DNA,RNA以及蛋白质等杂质。而在实验室广泛应用的提取质粒DNA的方法为传统碱裂解法,这种方法主要采用酚氯仿等有机试剂抽提蛋白质以及RNA酶消化RNA,最终所提取的质粒DNA无法满足动物注射级应用的DNA疫苗的标准。在实验室现有的条件下,我们如何获取制备DNA疫苗的工艺方法是迫切解决的问题。在本课题研究的第一部分即为摸索一种经济、简便的方法从而大量制备符合动物实验应用的DNA疫苗。首先尝试了一些简便的提取质粒的实验操作,这些操作都是在碱裂解法的基础上进行改进的,通过各种实验方法的比较最终获得了一种最为有效的提取质粒DNA的方法。该方法主要为传统碱裂解法与氯化钙、PEG8000试剂相结合提取质粒DNA,氯化钙可选择性沉淀质粒中的大量RNA,PEG8000可选择性沉淀超螺旋质粒DNA。此方法大大降低了质粒中蛋白质、宿主RNA、基因组DNA、有机物质等杂质的残留。将所提取的质粒粗提液通过Q Sepharose F.F.强阴离子交换柱去除内毒素,最终制备了约7mg的HIV-1gp120双质粒DNA(内毒素0.05EU/μg,浓度为2μg/μl)。经各项检测指标判断,质粒DNA的纯度以及含量均已满足后续动物实验应用的要求,并且制备DNA疫苗的成本低廉,操作简便,适合实验室应用。 大量实验证明佐剂能够增强DNA疫苗的免疫原性,我们选用佐剂MF59、CpGODN、WFR联合EP+GT(质粒DNA)免疫BALB/c小鼠,随机分为4组:EP+GT;MF59+EP+GT;CpG ODN+MF59+EP+GT;WFR+EP+GT。每组6只小鼠,采用胫前肌肉注射的方式免疫,一共免疫三次,每次间隔2周。分别在不同时间点取小鼠血清,用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗gp120特异性IgG体液免疫应答,结果表明应用WFR佐剂组的小鼠体液免疫应答水平与其他各组相比效果较好。在初次免疫后的56天用MTT法检测WFR+EP+GT组、EP+GT组及空白对照组小鼠脾细胞增殖能力,结果表明,gp120多肽对各组小鼠脾细胞均有刺激作用,用终浓度为1μg/ml gp120多肽比用10μg/ml gp120多肽更易刺激体外脾细胞的增殖情况,但是并无统计学差异。在有或无gp120多肽刺激的条件下,EP+GT+WFR组小鼠脾细胞的增殖程度均大于EP+GT组小鼠及健康空白小鼠的脾细胞增殖程度,具有统计学意义。用PFR佐剂免疫小鼠,随机分为2组:EP+GT,PFR+EP+GT,每组7只,分三次胫前肌肉注射免疫,间隔2周,分别在不同时间点检测小鼠体内针对gp120多肽的特异IgG体液免疫应答。结果发现PFR+EP+GT组的小鼠与单独应用质粒组的小鼠相比对抗原刺激产生更显著的体液免疫应答,并且在免疫后87天两组小鼠血清中抗gp120抗体仍然维持较高水平。 本研究主要通过对提取质粒方法学的摸索,获得了一种制备动物实验应用的DNA疫苗的简便方法。将不同佐剂与HIV-1gp120DNA疫苗联合应用,结果表明WFR、PFR佐剂具有增强DNA疫苗免疫原性的作用,为进一步对该佐剂的深入研究提供了实验基础。


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