核盘菌交配型基因MAT-2的克隆及其功能验证

【摘要】：核盘菌是一种能寄生在油料作物和十字花科的子囊菌，其寄主范围广泛，形成的菌核病能严重影响我国粮食的产量。核盘菌是同宗配合的兼性寄生菌，有性生殖产生的子囊孢子是菌核病流行的主要来源，因此，对有性生殖相关的MAT-2基因的功能研究，有助于揭示核盘菌有性生殖的分子机制，为菌核病的防治开辟一个新途径。 1本研究克隆了核盘菌MAT-2基因的完整开放阅读框，通过序列分析，发现该基因含有保守的结构域HMG-box，该结构域编码一种DNA结合蛋白，ORF能编码394个氨基酸，分子量为44.73kDa，大小为1185bp，等电点pI＝8.13。经过生物信息学的分析，我们确定了该基因与MAT-1基因的位置关系，发现MAT-2和MAT-1存在于核盘菌基因组的同一条染色体上，两个基因的间距为1657bp。通过构建系统进化树，可以看出获得的交配型基因位于第一个分支中，并且与其他菌株的MAT-2基因的同源性较高。通过蛋白质的二级结构预测可以看出，该基因编码蛋白质的二级结构含有48.48%的随机卷曲。并成功构建原核表达载体，经过IPTG的诱导，SDS-PAGE检测，获得目的蛋白，为制备特异性抗血清奠定了基础。 2本研究利用Real Time PCR的方法检测核盘菌MAT-2基因的表达动态。本实验以菌丝，不同时期的菌核和子囊盘为材料，提取RNA，进行Real Time PCR的扩增，通过分析融解曲线确定引物的特异性，确定三对引物可以用于该检测，之后采用相对定量PCR的方法进行表达动态的检测，并设置两个核盘菌的管家基因为参照。发现MAT-2基因在菌丝中表达量最低，而在菌核5、6期表达量明显高于其他各个时期。5期高于6期可能是因为6期为菌核的成熟时期，内部菌丝活性下降，因此，MAT-2基因的表达量略低于5期。利用荧光定量PCR检测MAT-2基因的表达时间动态，丰富了核盘菌有性生殖的研究。 3本研究利用Glucanex酶解核盘菌菌丝体，制备核盘菌的原生质体，通过overlapping PCR的方法构建敲除转化片段，并成功采用PEG-CaCl2的方法将其转化到核盘菌的原生质体中，经过原生质体的再生培养和潮霉素抗性的筛选培养，获得敲除MAT-2突变体转化子，并对其进行生物学特性分析和致病性分析。本实验利用多种PCR扩增的方法，验证了敲除转化子。与野生型菌株进行对照，发现敲除转化子在菌丝致密程度，形成菌核的数量及菌丝的分支角度和数量上均发生了变化。通过比较野生型菌株与敲除转化子菌株的致病性，发现敲除MAT-2基因的转化子，其致病性显著降低，确定了交配型基因与致病性之间的关系，为揭示核盘菌有性生殖的机制，奠定了基础。