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牛布鲁氏菌S19株VirB12分子标记疫苗的构建及其功能分析

王冲  
【摘要】:布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种由布鲁氏菌引起的人兽共患的传染病,世界各地均有流行。疫苗预防接种是防治布鲁氏菌病的重要手段。牛用的主要疫苗是弱毒活疫苗S19,但是该型疫苗的保护力不高,安全性低,可引起人与动物发病,且不能用血清学方法区分感染动物是自然感染还是人工接种疫苗。如果广泛使用这种疫苗,将会给布鲁氏菌病的流行病学调查和对疫源地的防控带来困难,更严重的缺点是该型疫苗有可能返祖,存在散毒的潜在危险。 基于以上原因,本研究的思路是运用同源重组技术,定向改造牛布鲁氏菌病疫苗S19的基因,改造疫苗功能,提高安全性,加以分子标记,使得血清学方法可以区分感染动物是自然感染还是接种S19改造疫苗。 根据GeneBank中登录的牛布鲁氏菌S19的基因序列设计virB12基因的N端和C端同源臂序列的引物,以S19基因组为模板,扩增出virB12基因的N端和C端同源臂序列,同时扩增枯草杆菌中SacB基因序列,将各序列同pMD18-T连接,双酶切后同自杀性质粒pBK-CMV连接,构建pBK-virB12-N-C-SacB,转化S19感受态细胞,筛选出VirB12基因缺失株S19ΔvirB12。 为研究缺失株S19ΔvirB12的功能,通过感染巨噬细胞RAW264.7检测S19ΔvirB12在巨噬细胞内的存活能力;以BALB/C小鼠为试验动物模型对S19ΔvirB12进行毒力和安全性评价,用1×106CFU剂量的S19和S19ΔvirB12接种小鼠,每组50只,同时设置对照组;用流式细胞仪分析小鼠外周血中CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群,并用ELISA方法检测小鼠血清中的IL-2和IFN-γ,评价S19ΔvirB12的免疫反应;在接种第六周,用1×105CFU剂量的B.abortus2308对小鼠进行攻毒试验,评价S19ΔvirB12对小鼠的免疫保护力。 根据牛布鲁氏菌S19的virB12基因序列设计引物,扩增virB12基因,连接pET28a~+构建重组表达载体pETvirB12,转化BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白,用组氨酸结合树脂柱纯化目的蛋白,Western blot分析目的蛋白的免疫原性,用纯化的VirB12蛋白建立IELISA鉴别S19ΔvirB12和S19接种的小鼠,并用VirB12蛋白建立IELISA检测牛布鲁氏菌血清抗体。 结果表明,构建的布鲁氏菌基因缺失株S19ΔvirB12与亲本株S19相比,其毒力降低,免疫保护力相当,安全性提高; Western blot分析显示,VirB12蛋白可与S19接种的小鼠血清反应,具有良好的免疫原性,与S19ΔvirB12接种的小鼠血清不反应;IELISA方法可以区分S19ΔvirB12和S19接种的小鼠血清,因此本研究所构建的基因缺失株S19ΔvirB12具有毒力低、安全性高、可用血清学方法区分的潜在疫苗株。


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