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白细胞介素-23对哮喘小鼠记忆T细胞增殖功能的影响

李艳春  
【摘要】:研究背景: 支气管哮喘目前被认为是一种Th2优势的疾病,记忆T细胞处于其发病机制的上游环节,它能够在哮喘机体长期存在,并维持Th2细胞的形态和功能,当机体再次接触同种过敏原时,记忆T细胞能够迅速增殖、活化为Th2细胞,分泌Th2细胞因子,引发气道炎症。因此,了解记忆T细胞在哮喘机体中的作用机制和规律,寻找可以调控记忆T细胞增殖与活化的物质,将有利于我们以记忆T细胞为靶点,探寻有效防治哮喘的新措施。IL-23能够促进正常机体记忆T细胞的增殖与活化,同时IL-23又能够促进哮喘小鼠Th2气道炎症,那么,IL-23是不是通过促进哮喘小鼠记忆T细胞增殖、从而促进哮喘Th2气道炎症的呢?本研究试图解答该问题,为治疗哮喘提供新思路。 研究目的: 1.了解哮喘小鼠肺脏、脾脏记忆T细胞比例在哮喘不同时期的变化规律,确定观察记忆T细胞增殖功能的最佳时间点,并为深入研究记忆T细胞在哮喘中的功能奠定基础; 2.明确抑制IL-23是否能够减少哮喘小鼠肺脏记忆T细胞的数量,试图揭示IL-23参与哮喘Th2气道炎症的作用机理。 研究方法: 1.应用OVA致敏、激发小鼠,构建哮喘小鼠动物模型,于激发前1天始至激发后30天,按规定时间点处死小鼠,分离脾脏、肺脏,制成单个核细胞悬液,应用流式抗体、流式细胞仪检测小鼠脾脏、肺脏记忆T细胞比例,确定观察记忆T细胞增殖功能的最佳时机; 2.根据小鼠IL-23p19基因序列设计干涉靶序列,慢病毒包装,体外感染小鼠细胞系,通过实时-PCR法检测细胞内IL-23p19mRNA表达水平,筛选出能够沉默小鼠IL-23p19基因的有效序列; 3.将小鼠分为正常组、哮喘组、空载体组、哮喘IL-23p19基因沉默组,后2组模型致敏、激发方法与哮喘组相同,在第1次激发前1天经鼻滴入携带有空载体或有效干涉靶序列的慢病毒液。于前期实验确定的最佳时机处死小鼠,进行相关指标的检测,包括实时-PCR、免疫组化法检测IL-23p19基因体内沉默效果,流式细胞仪分析肺组织中记忆T细胞比例,实时-PCR法检测肺组织转录因子T-bet、GATA-3、RORC表达水平,HE染色、刚果红染色观察肺组织病理学改变以及PCR检测Th2细胞因子表达水平等哮喘炎症指标。 结果: 1.记忆T细胞检测结果 ⑴哮喘小鼠脾脏、肺脏CD4~+、CD4~-记忆T细胞比值均比正常小鼠明显增高(p0.0001); ⑵CD4~+记忆T细胞变化规律:哮喘小鼠脾脏、肺脏CD4~+记忆T细胞在应用OVA激发后持续上升,激发停止后仍继续上升,肺脏CD4~+记忆T细胞在末次激发后2~9天达到高峰,峰值超过50%,后逐渐下降;脾脏CD4~+记忆T细胞在末次激发后7天达到高峰,峰值超过40%,后逐渐下降。至末次激发后30天,脾脏、肺脏记忆T细胞均回降至激发前水平; ⑶CD4~-记忆T细胞变化规律:哮喘小鼠肺脏CD4~-记忆T细胞在应用OVA激发后持续上升,末次激发后2天达到峰值,然后迅速下降,至末次激发后7天时下降至激发前水平;脾脏CD4~-记忆T细胞于激发7天后始上升,维持在30%左右,于末次激发后14天下降至激发前水平; ⑷在本模型的构建条件下,观察小鼠肺脏记忆T细胞增殖功能的最佳时机为末次激发后2天; 2.沉默哮喘小鼠肺脏IL-23p19基因表达对小鼠的影响 ⑴记忆T细胞:哮喘基因沉默组小鼠肺脏CD4~+记忆T细胞占CD4~+T细胞比值较哮喘组降低(p 0.0001),CD4~-记忆T细胞占CD4~-T细胞比值无变化(p0.05); ⑵Th2气道炎症:基因沉默组小鼠肺组织Th2细胞因子IL-4、IL-13mRNA表达较哮喘组降低(p 0.001,p 0.0001),肺组织炎症病变程度、嗜酸性粒细胞气道浸润均较哮喘组减轻(p 0.05,p 0.0001); ⑶转录因子:哮喘基因沉默组小鼠肺组织Th2转录因子GATA-3、Th1转录因子T-bet mRNA表达较哮喘组减低(p 0.0001);Th17转录因子Rocr mRNA表达无变化(p0.05)。 结论: 1.哮喘小鼠体内的记忆T细胞在哮喘不同时期呈现出一定的规律:⑴无论CD4~+还是CD4~-记忆T细胞,肺脏总是先于脾脏升高,且在哮喘急性期,肺脏记忆T细胞的比例显著高于脾脏;⑵在哮喘效应器官肺脏,CD4~+与CD4~-记忆T细胞均参与了哮喘的发病,其中CD4~+记忆T细胞是引起哮喘气道炎症持续的主要细胞,CD4~-记忆T细胞可能在哮喘急性发作方面发挥了作用; 2.抑制IL-23表达能够减少哮喘小鼠肺脏CD4~+记忆T细胞的增殖,抑制Th2转录因子GATA-3的表达,同时能够减轻哮喘气道炎症,提示IL-23有可能通过调控CD4~+Tm的增殖来参与哮喘Th2气道炎症,IL-23主要对CD4~+Tm发挥作用。


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