收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

犬新孢子虫宿主细胞结合蛋白筛选及其免疫原性分析

吕强  
【摘要】:新孢子虫病是一种新发现的,由新孢子虫引起的胞内寄生性原虫病,主要引起孕畜流产或产死胎,以及新幼畜的运动障碍和神经系统疾病,该病呈世界性分布,危害严重,给养殖业带来极大的经济损失,但目前尚无有效的预防新孢子虫病的疫苗。本研究在构建新孢子虫速殖子T7噬菌体展示文库基础上,利用Vero细胞对文库进行筛选后获得了宿主细胞结合蛋白,并利用筛选后的蛋白制备了新孢子虫重组蛋白苗和核酸疫苗,并确定了单独免疫和联合免疫的保护效果,为新孢子虫病的预防奠定了基础。 利用T7select10-3b载体构建了新孢子虫速殖子T7噬菌体展示文库,扩增后文库滴度为5.24×1012pfu/mL,库容量为8.38×1012个重组子,文库重组率为100%。利用Vero细胞对构建的展示文库进行筛选,经过5轮亲和筛选后获得了9个阳性克隆,经测序后Blast分析,包括一个致密颗粒GRA7基因、5个核糖体基因和3个假定蛋白基因。本研究选取了其中一个假定蛋白和GRA7蛋白作为疫苗候选,以研究它们的保护效果。选择的假定蛋白氨基酸序列与弓形虫酰基甘油脂酶同源性为80%,暂根据其编码的蛋白大小命名为NcP78。 利用原核表达载体pGEX-4T-1和pET-28a分别表达NcP78和GRA7重组蛋白,经SDS-PAGE和Western-Blot鉴定该蛋白均得到了表达。利用真核表达载体pVAX1分别制备了NcP78和GRA7基因的核酸疫苗,经Western-Blot和IFA鉴定该蛋白均得到了表达。 用新孢子虫NcP78、GRA7重组蛋白和核酸疫苗分别免疫及核酸/蛋白联合免疫母鼠后,测定IgG、IgG1、IgG2a、IL-4和IFN-γ表达水平。结果表明免疫小鼠IgG抗体水平升高,且IgG2a抗体和IFN-γ表达水平升高,表明重组蛋白可激发机体产生Th1型免疫反应,IgG1抗体和IL-4表达水平升高,表明可激发机体产生Th2型免疫反应,综上结果表明,NcP78疫苗和GRA7疫苗可激发小鼠机体产生Th1/Th2型免疫反应。 免疫血清体外侵入抑制试验表明,NcP78重组蛋白免疫血清和GRA7重组蛋白免疫血清体外抑制率分别为40%和55%;NcP78核酸疫苗免疫血清和GRA7核酸疫苗免疫血清体外抑制率分别为40%和50%;NcP78核酸/蛋白联合免疫血清和GRA7核酸/蛋白联合免疫血清体外抑制率分别为45%和70%,表明免疫血清可抑制新孢子虫对宿主细胞的侵入,并且NcP78和GRA7为新孢子虫宿主细胞结合蛋白。 免疫母鼠怀孕10天后感染新孢子虫,通过母鼠和后代仔鼠的存活率、脑组织中虫体数量等评价重组疫苗对新孢子虫保护效果。 (1)新孢子虫NcP78、GRA7重组蛋白免疫保护效果研究结果表明,NcP78和GRA7重组蛋白免疫后可显著提高小鼠的存活率(NcP78组、GRA7组和空白感染组的存活率在母鼠中分别为60%,70%和40%,在仔鼠中分别为68.4%,73.7%和42%)。荧光定量Realtime-PCR表明,2个重组蛋白均可减轻脑部新孢子虫的感染(计数每20ng脑组织中新孢子虫的数量,NcP78疫苗组、GRA7疫苗组和空白感染组在母鼠中分别为356.66±14.94,259.59±19.02和521.6±7.1,而在仔鼠中分别为64.53±4.47,48.83±2.76和106.78±7.67)。此外,两个重组蛋白免疫可改善小鼠体重减轻、产仔数减少和流产等新孢子虫病症状。以上结果表明,GRA7和NcP78重组蛋白对新孢子虫具有一定保护效果,且GRA7重组蛋白的保护效果好于NcP78重组蛋白。 (2)新孢子虫核酸疫苗免疫保护效果研究结果表明:NcP78和GRA7核酸疫苗可显著提高小鼠的存活率(NcP78组、GRA7组和空白感染组在母鼠中的存活率分别为60%、60%和40%,在仔鼠中分别为:53.8%,58.3%和42%)。荧光定量试验表明,两种核酸疫苗可减轻脑部新孢子虫的感染(计数每20ng脑组织中新孢子虫的数量,NcP78组、NcP78组和空白感染组在母鼠脑组织中数量分别为378.8±27.95,287.17±32.51和521.6±7.1,在仔鼠中其数量分别为58.37±5.77,45.39±6.73和106.78±7.67)。表明NcP78和GRA7核酸疫苗对新孢子虫感染具有一定保护效果,GRA7重组核酸疫苗的保护效果好于NcP78重组核酸疫苗。 (3)核酸/蛋白联合免疫保护效果研究结果表明:NcP78的核酸/蛋白联合免疫和GRA7的核酸/蛋白联合可显著提高小鼠的存活率(NcP78联合免疫组、GRA7联合免疫组和空白感染组在母鼠中的存活率分别为60%,70%和40%;而在仔鼠中分别为61.1%,66.7%和42%)。两种联合免疫可减轻脑部新孢子虫的感染(计数每20ng脑组织中新孢子虫的数量,NcP78联合免疫组、GRA7联合免疫组和空白感染组在母鼠脑组织中分别为:338.8.45±10.09,308.99±53.47和521.6±7.1;在仔鼠中分别为69.39±4.82,52.27±3.74和106.78±7.67)。表明NcP78的核酸/蛋白联合免疫和GRA7的核酸/蛋白联合对新孢子虫具有一定保护效果,且GRA7的联合免疫保护效果好于NcP78联合免疫保护效果。但这两种联合免疫所取得的保护效果与单独的蛋白疫苗或核酸疫苗相比,并没有显著加强。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 许波;虻对微粒孢子虫病的机械传播[J];中国兽医科技;1985年02期
2 丁成曙,徐国成;鲫鱼黏孢子虫病的诊断与防治[J];科学养鱼;2005年10期
3 章忠;;如何防治鲫鱼黏孢子虫病[J];渔业致富指南;2006年24期
4 刘新华;孢子虫病的简易检查方法[J];中国养蜂;1994年05期
5 陈昌福,张松柏;“孢杀”对异育银鲫孢子虫病的室内治疗试验[J];科学养鱼;2004年03期
6 刘学敏,罗泗泽,王亚民,刘正军;牛贝诺孢子虫病的治疗[J];中国兽医科技;1985年06期
7 谢碧文;网箱养殖鲤鱼鳃上孢子虫病的预防和治疗[J];科学养鱼;2001年07期
8 叶建生;;鲫鱼孢子虫病防治技术[J];渔业致富指南;2009年13期
9 姜言辅,胡力生;间接酶联免疫吸附试验诊断牛贝诺孢子虫病的试验研究[J];中国兽医学报;1986年02期
10 宋丹;华连有;宋毅;;鲤鱼黏孢子虫的防治[J];新农业;2010年03期
11 ;鱼类孢子虫病的防治[J];科学养鱼;2003年08期
12 满玉梅,刘庆国,张桂云;鲤鱼成鱼肤孢子虫病的治疗实例[J];渔业致富指南;2003年23期
13 祝长江;;蜂病综合治疗之我见[J];中国蜂业;2010年09期
14 膝国麟,周志勇,许婉茹;牛贝诺孢子虫病例皮肤病理形态学观察[J];中国兽医科技;1987年01期
15 谢碧文,黎春晖;网箱养殖鲤鱼鳃上孢子虫病的预防和治疗[J];中国水产;2001年07期
16 赵广哲;奶牛血孢子虫病诊治体会[J];湖北畜牧兽医;2002年05期
17 杨雨辉,佟恒敏,卢彤岩,阚立抒;鲤鱼黏孢子虫病在黑龙江地区的发生、诊断和防治[J];黑龙江畜牧兽医;2003年02期
18 张肇富;控制牛血孢子虫病的有效方法[J];畜禽业;1999年06期
19 刘昌璜,郭标棠;鱼种孢子虫病防治的初步探讨[J];淡水渔业;1976年12期
20 胡世然;杨通武;何建荣;潘昌胜;邓忠;;鲤鱼暴发黏孢子虫病的诊断与防治[J];科学养鱼;2010年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘晶;余劲术;张维;邓冲;丁隽;汪明;刘群;;新孢子虫重组NcSAG1-SRS2蛋白间接ELISA方法的建立及牛新孢子虫病流行病学的初步调查[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
2 张昌盛;刘群;;奶牛新孢子虫病病原分离、鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
3 张维;刘晶;刘群;姚雷;胡月凤;杨娜;;牛群中新孢子虫病传播途径的初步研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
4 沈莉萍;刘佩红;徐锋;薛霞;;上海地区奶牛新孢子虫病血清学调查[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(下)[C];2005年
5 姚雷;杨娜;张维;钱伟峰;胡月凤;丁隽;刘群;;巢式PCR检测奶牛流产胎儿体内的新孢子虫[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
6 遇秀玲;陈南华;胡冬梅;张维;李晓霞;汪宝玥;康立平;李向东;刘群;田克恭;;中国养殖蓝狐(北极狐)幼狐中新孢子虫病的鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
7 贾立军;张守发;;牛新孢子虫抗体Dot-ELISA检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
8 张维;邓冲;遇秀玲;卢计委;刘晶;刘群;;新孢子虫的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 马利青;廖敏;Hiroshi Suzuki;玄学南;;犬新孢子虫二硫氢键异构酶蛋白的表达、克隆和鉴定[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
10 刘善超;刘群;张维;刘晶;;北京地区犬新孢子虫病和弓形虫病的血清流行病学调查[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 雷涛;棒状体蛋白18介导弓形虫和新孢子虫毒力差异的分子机制研究[D];中国农业大学;2014年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 大富;防治蜂群孢子虫病[N];新疆科技报(汉);2007年
2 湖北远安县农技中心 杨玉凤 李小玲 刘剑霞 胡枭;鲤鱼孢子虫病防治新法[N];河北科技报;2006年
3 吴桂亮;黑鱼孢子虫病防治方法[N];江苏农业科技报;2007年
4 丁丽萍;蜂群防治孢子虫病[N];云南科技报;2007年
5 ;蜂群怎样防治孢子虫病[N];中国畜牧兽医报;2008年
6 纪增;蜜蜂螺原体病的防治[N];中国畜牧兽医报;2006年
7 繁德 孔维真;三项行标填补国内空白[N];中国国门时报;2010年
8 ;蜜蜂病害的种类及预防[N];中国畜牧兽医报;2008年
9 金慰鄂;大蒜素能治两种新型腹泻[N];大众卫生报;2007年
10 杨国义 张晋新;蜜蜂常见病虫害的安全防治[N];山西科技报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978