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内蒙古通辽地区奶牛布鲁氏菌病流行病学调查和感染机理初步分析

李向阳  
【摘要】:布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的以家畜为主要传染源的人畜共患传染病。目前,人畜布病存在很多国家,2000年以后,我国人畜布鲁氏菌病有逐年上升的趋势,畜间也有单个群的爆发现象,对人的健康和畜牧业造成了巨大危害。这些都反映着国内畜间布鲁氏菌病的流行程度。布病治疗和控制涉及的原因是很多的,其致病机理、胞内生存机制不十分清楚是关键。 本研究在2009~2011年间对内蒙古通辽地区多个不同的奶牛场布鲁氏菌病流行病学调查,共采集5875份未经免疫的奶牛血清及1931份奶样。采用RBT、SAT、MRT、 CFT等四种不同的血清学方法进行检测,结果表明,通辽市奶牛群间布鲁氏菌病仍然在流行,感染率呈现出明显的场间不均衡性,且较为严重。初步认为其可能与疾病预防和防治、奶牛饲养周期长、淘汰率低、奶牛交易、运输频繁等有关。 为了更好的控制布病的流行,我们通过对布病的分子机制研究,寻找布病的致病机制。由于布鲁氏菌能够感染巨噬细胞,并能在其中生存复制,考虑细菌蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用可能与布鲁氏菌感染具有相关性。研究中发现,由于Omp22属于布鲁氏菌第3组外膜蛋白Omp22/Omp31家族中的一员,如果奶牛个体缺失Omp22基因,其体内布鲁氏菌突变株并不会引起宿主流产,而且在宿主体内能够增殖,与毒力作用较其亲本株明显减弱,并且使其体液免疫也在一定程度上减弱,由此可见,Omp22不仅是毒力因子而且也是免疫原性蛋白。基于以上实验结果,为了进一步探讨布鲁氏菌的分子致病机制和胞内寄生机制,本研究拟运用牛布鲁氏菌544A株感染小鼠巨噬细胞cDNA文库,再将Omp22作为诱饵蛋白,进而从该文库中筛选鉴定互作蛋白。 利用分子生物学技术对牛布鲁氏菌544A株Omp22进行克隆、测序、生物信息学分析。首先构建诱饵载体(即把Omp22连接到pSos载体),并检测诱饵载体的自激活性、毒性以及膜定位情况。实验中,针对诱饵质粒和pMyr-cDNA文库质粒共转化cdc25Hα酵母感受态细胞这一过程进行互作蛋白的筛选。结果表明,牛布鲁氏菌16M株Omp22基因克隆正确,构建的诱饵载体对酵母细胞无自激活性、膜定位准确,无毒副作用,能够应用于酵母双杂交实验中。 实验表明,将诱饵质粒和pMyr-cDNA文库质粒共转化cdc25Hα酵母感受态细胞进行酵母双杂交,结果筛选到2个阳性克隆,经测序两个基因均为NDAH还原酶装备因子2(Mus musculus NADH dehydrogenase ubiquinone)。通过以上实验,我们可以提出如下假设:Omp22和Ndufaf2结合后,可以促进细胞中NADH浓度增加,提高NADH活性,降低巨噬细胞对布鲁氏菌的氧化杀伤,从而创造了有利于布鲁氏菌胞内生存的条件。 综上,本研究针对内蒙古通辽地区畜牧业生产一线出现的奶牛布鲁氏菌病,进行流行病学调查,掌握了苏木嘎查(村)基层的布病流行情况,并依靠实验室检测,为准确判断疫情提供技术支持。此外,本研究以通辽地区布鲁氏菌株成功筛选并鉴定了布鲁氏菌第3组外膜蛋白Omp22的互作蛋白Ndufaf2,为进一步研究布鲁氏菌Omp22免疫原性及相关功能奠定基础,为揭示布鲁氏菌分子致病机理和胞内寄生机制提供理论依据。


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