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狂犬病病毒靶向RNA干扰制剂的研制与鉴定研究

杨玉姣  
【摘要】:狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RABV)引起的一种人兽共患烈性病,该病分布于全世界在发展中国家尤其普遍。目前控制狂犬病的有效措施是暴露前预防接种疫苗,一旦出现临床症状目前尚无确切有效的治疗手段,其致死率几乎100%,狂犬病如此高的死亡率,一个重要的原因是缺乏理想的暴露后治疗药物。狂犬病病毒在体内显示很强神经嗜性,血脑屏障(blood–brain barrier,BBB)的存在妨碍了治疗分子从血液进入大脑。要治疗狂犬病需要研发一种能有效跨越BBB发挥抗病毒效应的方法。 RNA干扰(RNA interference, RNAi),是一种能够有效抑制基因表达的靶向性转录后基因沉默机制,被广泛应用于抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病防治等许多领域,已经发展成为一种非常有潜力的基因治疗手段。然而,目前尝试的RNAi大部分都是针对局部给药,例如眼睛和肺部。而大多数疾病的治疗需要全身性给药,因此高效的靶向运送方式是全身性RNAi治疗进入临床应用最关键的环节。 Kumar等于2007年在Nature杂志上公布了一种利用狂犬病病毒糖蛋白中由29个氨基酸组成的小肽(RVG29)将小干扰RNA(siRNA)靶向递送至中枢神经系统的方法,这种RVG29小肽能与神经细胞及BBB血管内皮组织上的烟碱乙酰胆碱受体(AchR)特异性结合,通过受体介导的胞吞转运作用实现药物的跨血管递送,在其末端连接一段带正电荷的九聚精氨酸(9R)肽用以结合带负电的siRNA。体内外实验证明了这个RVG29-9R能够结合并运输siRNA进入神经细胞,并引起有效的基因沉默。然而目前所使用的RVG29肽均需人工合成,价格昂贵。 本课题利用基因工程原理构建并表达RVG29-9R短肽,将其与筛选的狂犬病病毒siRNA(shRNA表达质粒形式)融合,制备狂犬病病毒靶向RNA干扰制剂,用于狂犬病的暴露后治疗。 在本实验中,我们构建了重组质粒pGEX-4T-1/RVG29-9R-6His,通过原核表达系统表达融合蛋白GST-RVG29-9R-6His,并利用凝血酶酶切除去GST后,纯化回收RVG29-9R-6His短肽,最终100mL细菌菌体可以获得40mgGST-RVG29-9R-6His和6mg RVG29-9R-6His纯化蛋白。基于小鼠神经瘤细胞Neuro2a细胞的ELISA实验结果显示RVG29-9R-6His短肽能识别结合表达有特异性受体的神经细胞Neuro2a,说明通过原核表达所获得的靶向载体RVG29-9R-6His保留有RVG29的神经细胞识别功能。 为了筛选出可通用于多种毒株的特异性siRNA,我们选择了RABV五个结构蛋白基因中最为保守的N基因为靶标,理论筛选出6个针对N mRNA的siRNA(N473, N580, N783, N796, N799和N1227),并构建其对应的shRNA表达载体瞬时转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),通过直接免疫荧光法、病毒滴度测定、real-timeRT-PCR和Western blotting检测进一步筛选出三个能有效抑制RABV复制的siRNA(N796, N580和N799),并且其干扰时间可持续长达4天;随后在小鼠体内对该三个siRNA的干扰效果进行了评估验证,结果显示三者均能在一定程度上有效保护小鼠免受致死量RABV攻击。 将靶向载体RVG29-9R-6His与所筛选的siRNA(shRNA表达质粒形式)通过静电相互作用结合制备成靶向制剂RVG29-9R-6His/shRNA,随后利用细胞毒性检测、凝胶阻滞实验、粒径与表面电荷检测、细胞识别特异性和体外转染效率等对靶向制剂RVG29-9R-6His/shRNA各种理化特性进行鉴定优化。之后在小鼠体内对其狂犬病暴露后疗效进行评估,小鼠颅内攻毒后6h通过静脉注射给药RVG29-9R-6His/shRNA,给药后24h加强给药一次,连续观察21天后小鼠存活率为60%,病毒对照组小鼠全部死亡。静脉给药后48h取小鼠心、肝、脾、肾、脑组织进行免疫组化分析,结果显示靶向制剂RVG29-9R-6His/shRNA给药后药物主要集中于脑组织中,外周组织分布较少;而利用非靶向载体脂质体递药后药物主要集中于外周组织,脑中无药物分布。 本实验成功制备了靶向制剂RVG29-9R-6His/shRNA,并证明它可特异识别并结合Neuro2a神经细胞(表达有特异性的烟碱乙酰胆碱受体AchR),可在狂犬病病毒感染小鼠体内将shRNA有效递送到达脑部发挥显著疗效。这为狂犬病的暴露后治疗提供了新的手段及工具,并为脑部靶向递药系统增添了一种新的更经济的策略。


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