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吴茱萸碱对SPC-A1细胞微管蛋白表达的影响及机制研究

田秀丽  
【摘要】:吴茱萸为芸香科植物吴茱萸的近成熟果实。吴茱萸碱(Evodiamine)是吴茱萸的主要活性成分之一,现代药理研究证明,吴茱萸碱具有抗肿瘤、护心降压、调节体温、减肥、调节内分泌、调节免疫、抗炎等多种药理学活性。我们已经通过大量的研究证明,吴茱萸碱不论是在动物体内还是在细胞体外,都具有明显的抗肿瘤作用。它可以启动caspase-3,8依赖的途径诱导人肺腺癌细胞(SPC-A1)凋亡发生而实现抑制肿瘤细胞分裂增殖进而杀死肿瘤细胞的全过程。 本实验通过研究吴茱萸碱对SPC-A1细胞微管蛋白表达的影响来研究其抗肿瘤作用机制。采用免疫荧光化学染色法,通过激光共聚焦显微镜观察吴茱萸碱作用于SPC-A1细胞后对α-tubulin的影响及其形态学变化。采用MTT法检测吴茱萸碱和MG132分别对细胞增殖的影响,以及二者共同作用对细胞增殖的影响。利用Western blot法检测吴茱萸碱对α-,β-,γ-tubulin表达的变化,以及吴茱萸碱与MG132共同作用后α-,β-,γ-tubulin表达的变化。采用流式细胞术检测吴茱萸碱对SPC-A1细胞周期的影响,及MG132对吴茱萸碱诱导的细胞周期变化的影响。分别将0,0.25,0.5,0.75,1μg/ml的吴茱萸碱作用于SPC-A1细胞4h,0.5μg/ml吴茱萸碱作用于细胞8h后,在激光共聚焦显微镜下可看到α-tubulin结构被破坏,并且随着药物浓度和作用时间的增加,微管结构破坏的严重性也增加,呈现时间和剂量的依赖性。吴茱萸碱能够抑制SPC-A1细胞的增殖,而与MG132共同作用后,其抑制作用明显减弱,对细胞的杀伤作用显著减小。吴茱萸碱能够抑制α-tubulin的表达,呈时间和剂量依赖性,而对β-,γ-tubulin的表达没有影响。与MG132共同作用于细胞,α-tubulin的表达可恢复到正常水平,β-,γ-tubulin的表达仍没有变化。吴茱萸碱能够诱导SPC-A1细胞周期阻滞在G2/M期,有明显的剂量和时间的依赖性。而MG132单独作用,也可引起SPC-A1细胞周期阻滞于G2/M期,二者共同作用后,吴茱萸碱引起的细胞阻滞作用减弱,即MG132能够在一定程度上逆转由吴茱萸碱引起的SPC-A1细胞细胞周期阻滞。 吴茱萸碱可通过抑制SPC-A1细胞α-tubulin蛋白表达,破坏微管结构,诱导SPC-A1细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞有丝分裂,进而抑制细胞增殖。蛋白酶体抑制剂MG132可逆转吴茱萸碱引起的SPC-A1细胞生长抑制,抑制吴茱萸碱引起的α-tubulin蛋白表达下降,并在一定程度上减弱吴茱萸碱引起的G2/M周期阻滞,提示我们吴茱萸碱是通过调控α微管蛋白的表达和微管形成,引起细胞骨架破坏,导致细胞周期阻滞于G2/M期最终抑制细胞增殖。


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