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PRRSV诊断方法的建立及鲁豫冀地区PRRSV的流行与遗传变异研究

唐娜  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪的严重呼吸系统与繁殖障碍疾病,目前仍然是影响养猪业健康发展的最重要的疾病之一。上世纪末至今,世界各国多个领域的人员,尤其是养殖场、兽医部门以及研究人员已经在猪繁殖与呼吸综合征的防控中投入了大量精力并取得了一定的成果。但截止目前,人们仍尚未破解PRRSV的致病机理、遗传变异等难题,该病仍在持续流行中,给全球养猪业造成巨大损失。综合开发PRRS病原学、血清学诊断方法,开展PRRS流行情况调查与流行毒株分离鉴定,分析PRRSV流行株的遗传变异趋势,对于正确开展防控技术研究,控制和减少PRRS的发生具有非常重要的意义。本论文以山东及周边(河南、河北)地区为研究范围,在开展流行毒株分离鉴定,建立PCR鉴别诊断方法、抗体诊断方法,研制单克隆抗体的基础上,开展了PRRSV流行病学调查,并分析了2007-2012年间山东及周边地区PRRSV流行株的遗传变异趋势。 分别以Nsp2基因、ORF7基因为靶基因,设计了2对引物,建立了鉴别检测PRRSV的RT-PCR诊断方法并进行了初步优化,可以特异灵敏地鉴别诊断缺失株与经典毒株、美洲株与欧洲株,分别能够检测到浓度低至0.01TCID50的美洲型(Ⅱ型)疫苗毒和0.1TCID50浓度的欧洲型(Ⅰ型)疫苗毒,重复性较好。应用克隆表达的重组N蛋白为包被抗原,初步构建了抗体间接ELISA检测方法,该方法能够特异性的检测病毒N蛋白抗体,与国际商品化试剂盒的检测符合率良好。以高致病性PRRSV病毒株经密度梯度离心纯化后免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合、阳性克隆的筛选鉴定,获得3株特异性识别PRRSV的单克隆抗体,其中7F2能够特异性识别N蛋白,6A4能够特异性识别GP5蛋白。病毒中和试验和抗体依赖性增殖作用试验表明,3株抗体均无促进病毒增殖作用,但6A4和3F1有病毒中和作用。3株抗体均具有较高的效价与特异性,在PRRSV的诊断与免疫学研究中具有很好的应用价值。 以MARC-145细胞为研究工具进行山东及周边地区流行PRRSV毒株的分离与鉴定,并对其中5株代表性毒株进行生物学特性等研究。其中1株为类似疫苗株(SDDY2007),4株为致病性毒株(SDBZ2006、HN2010、SDWF2010、HBXT2009),1株(HN2010)在MARC-145细胞上具有较低增殖能力,对其中SDBZ2006株进行了动物回归实验鉴定,确定其为高致病性毒株。 以建立的PCR与ELISA诊断方法开展山东省及周边地区PRRS流行情况调查,检测了957份血清样品中的PRRSV抗体和272份疑似病例组织、血液样本中的PRRSV病毒,各猪场PRRSV抗体平均阳性率49.8%,抗体阳性率从2007年至2012年间上下波动明显,但2012年有显著上升趋势,不同地区间抗体阳性率差异较大,PRRSV中和抗体平均为25.1%,不同地区间差异较大;PCR检测发现各地区猪场均存在PRRSV(阳性率26.84%),部分猪场出现一定程度混合感染;检测到1例Ⅰ型病毒感染,6例Ⅱ型传统病毒,1例传统株与缺失株共感染;不同病料组织器官,其病毒分离阳性率有所差异。对通过MARC-145细胞分离到的15株病毒株,并分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,推导氨基酸序列与GenBank中68个ORF5推导序列和41个Nsp2序列进行比对表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株与JXA1株有较高的同源性(95.5%~97.5%);1株(DY2007株)与疫苗株MLV和VR-2332株亲缘关系相近,而1株可能存在基因重组。 总之,试验所建立的PCR、ELISA和单克隆抗体具有较好的应用性,病毒分离、血清学调查、病原检测和遗传变异分析结果表明,2007~2012年间高致病性PRRSV是山东及周边地区的优势流行毒株,在该地区流行较为严重,存在一定比例混合感染,且可能存在基因重组毒株,而疫苗防疫尚未能发挥显著的作用;除高致病性毒株外,山东及周边地区仍然存在一定经典毒株如疫苗毒株和欧洲毒株,三省区流行毒株间有一定遗传差异,但没有明显地域特征。 本研究所建立的诊断方法、制备的抗体、分离的毒株以及取得的数据信息为开展PRRS防控研究提供了有效的技术工具和可靠的数据参考。


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