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钙激活氯离子通道ANO1在卵巢颗粒细胞中的表达与功能

孙美艳  
【摘要】:钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channel,CaCCs)是一类受细胞内钙离子调节的氯离子通道,广泛表达于各种组织并参与许多生理过程。2008年,未知功能的跨膜蛋白16A(transmembrane protein16A,TMEM16A,也称为ANO1)被确定为钙激活氯离子通道。近些年来,对ANO1钙激活氯离子通道蛋白结构与功能的研究成为一个热点领域,发现ANO1在唾液腺和肠道液体分泌、感觉神经传导、血管平滑肌和胃肠平滑肌的收缩调控等生理功能中发挥重要作用。但是,ANO1在生殖系统的表达和功能目前鲜有报道。 卵泡发育是一个十分复杂的过程并处于严格的调控系统当中,主要受到促性腺激素、性腺类固醇激素和一些局部因子的调节。卵巢颗粒细胞中所产生的雌激素在维持卵泡正常发育以及调节雌性生殖系统的结构和功能中发挥着重要的作用。雌激素水平的异常会引起卵泡发育障碍,导致女性内分泌紊乱和生育期女性不孕,如多囊卵巢综合症,卵巢早衰等;严重的可诱发生殖系统肿瘤,如卵巢癌、颗粒细胞癌等。本篇论文是研究钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中的表达以及它在雌激素调节中所发挥的作用,为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。 【目的】 钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中的表达以及它在卵泡发育和排卵过程中的功能和分子机制 【方法】 1.通过RT-PCR和Western Blot技术确定钙激活氯离子通道ANO1的mRNA和蛋白在小鼠卵巢中表达水平,通过免疫组织化学染色和免疫荧光技术分析钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中表达定位。 2.通过膜片钳技术(全细胞膜片钳和内面向外式膜片钳)对新鲜分离的卵巢原代颗粒细胞进行了电生理学特征分析,并分别使用了氯离子通道抑制剂(NFA)和钙激活氯离子通道ANO1的选择性抑制剂(T16Ainh-A01)来确定钙激活氯离子通道ANO1的电生理特征。 3.使用慢病毒载体介导的shRNA下调了原代培养的颗粒细胞中ANO1的表达量,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了ANO1下调后雌激素量的变化。为了确定钙激活氯离子通道ANO1的通道活性是否影响雌激素合成的量,我们在原代培养的颗粒细胞中使用了钙激活氯离子通道ANO1的选择性激活剂(Eact)和选择性抑制剂(T16Ainh-A01)。并通过Western Blot技术以及使用MEK/ERK信号通路抑制剂U0126分析了钙激活氯离子通道ANO1调节雌激素合成的分子机制。 4.通过以下3个实验分析钙激活氯离子通道ANO1的表达规律。(1)通过观察小鼠阴门外观及对小鼠阴道脱落细胞进行巴氏染色确定了小鼠的发情周期,应用实时定量PCR技术分析了处于不同发情周期的小鼠卵巢中钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。(2)使用孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)模拟了小鼠的卵泡发育和排卵过程,应用实时定量PCR技术分析了排卵过程中不同时间点小鼠卵巢颗粒细胞中钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。(3)体视显微镜下分离不同直径大小的卵泡,通过免疫组织化学染色和Western Blot技术,分析钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。 5.使用脱氢表雄酮DHEA诱导多囊卵巢综合症的小鼠模型,通过HE染色观察小鼠卵巢的形态变化;Western Blot技术分析钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化;ELISA方法检查小鼠血清中雌激素水平。 【结果】 1. RT-PCR结果表明ANO1、ANO4、ANO6和ANO10的mRNA在小鼠卵巢和原代培养的颗粒细胞中表达。Western Blot结果表明钙激活氯离子通道ANO1的蛋白(~114kDa)在小鼠卵巢和原代培养的颗粒细胞中也表达。免疫组织化学染色表明在小鼠卵巢颗粒细胞上有强特异性染色,其他细胞类型(卵泡膜细胞、间质细胞、卵母细胞和卵巢表面上皮细胞)也有染色,但相对较弱。对原代培养的颗粒细胞进行ANO1免疫荧光染色,结果显示ANO1表达于卵巢颗粒细胞质膜上。 2.单一的卵巢颗粒细胞用全细胞膜片钳方式记录到的电流在600nM [Ca2+]i时具有明显的外向整流特征,同时又具有钙依赖性和电压依赖性,这都符合经典CaCCs的电流特征。且这种电流可以被ANO1选择性抑制剂T16Ainh-A01所抑制,这提示卵巢颗粒细胞中的CaCCs是由ANO1所介导的。内面向外式膜片钳记录到的电流具有以下特征:当细胞钳制电位为50mV的时候,0[Ca2+]i时,没有得到电流;[Ca2+]i为1μM的时候电流为10pA左右,且此电流可被氯离子通道抑制剂NFA和ANO1选择性抑制剂T16Ainh-A01所抑制,进一步证实卵巢颗粒细胞中的CaCCs是由ANO1所介导的。 3. Western Blot结果表明以慢病毒为载体的靶向卵巢颗粒细胞ANO1的shRNA对原代培养的颗粒细胞中ANO1蛋白表达的抑制率平均为70%左右。ELISA结果显示在原代培养的颗粒细胞中下调ANO1的表达或者是使用ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01都能够提高雌激素的合成量,相反使用了ANO1特异性激活剂Eact,可以显著的抑制雌激素的合成。ANO1的表达或激活可以增加MEK和ERK1/2的磷酸化同时降低芳香化酶的表达量。使用了MEK抑制剂U0126后可以去除ANO1选择性激活剂Eact对MEK和ERK1/2磷酸化的调节作用,这提示ANO1可能是经过MEK/ERK信号通路对雌激素的合成具有负性调控作用。 4.在小鼠的发情周期中的发情前期和发情期,ANO1的表达量明显增加。体内试验表明PMSG可以诱导卵巢颗粒细胞中ANO1的表达,同时hCG也可进一步增加ANO1的表达量。对不同直径大小卵泡中ANO1表达量进行免疫组织化学染色和Western Blot的结果显示在卵泡发育阶段,随着卵泡的体积变大,ANO1的表达量也随之增多,ANO1的表达量在排卵前卵泡中最多,而在排卵结束后形成的黄体中ANO1的表达量下调明显。 5.在DHEA诱导的小鼠多囊卵巢综合症(PCOS)模型中,与对照组相比较,模型组中卵巢颗粒细胞ANO1的mRNA和蛋白的表达明显下调且小鼠血清中的雌激素明显上升。 【结论】 1.首次发现钙激活氯离子通道ANO1表达于哺乳动物卵巢颗粒细胞的质膜上。 2.小鼠卵巢颗粒细胞上的钙激活氯离子电流是由ANO1所介导。 3.小鼠卵巢颗粒细胞上钙激活氯离子通道ANO1是通过MEK/ERK途径下调芳香化酶的表达进而对雌激素的合成具有负性调节作用。 4.在小鼠发情周期中ANO1的表达具有时期特异性且受到促性腺激素的调节。ANO1可能参与了LH排卵峰诱导的排卵过程,为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。 5.在DHEA诱导的小鼠PCOS模型中,卵巢颗粒细胞中ANO1的表达显著下调。 【意义】 本研究首次发现了钙激活的氯离子通道ANO1表达于卵巢颗粒细胞的质膜上,以此发现为研究基础,深入的研究了钙激活的氯离子通道ANO1在颗粒细胞中的重要生理功能,可能是经过MEK/ERK信号通路对雌激素的合成具有负性调控作用,可能参与调节卵泡的发育与排卵,为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。


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