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T2DM四种易感基因与临床表型分析及荧光编码微球标识检测方法建立

陈琰  
【摘要】:2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)是一种由多种基因协同作用、并且受环境因素影响的慢性代谢性疾病,随着病程的延长,其慢性并发症给患者带来了严重的精神和经济负担。因此对2型糖尿病发病机制及其靶向干预的研究一直是研究的重点,具有重要的意义。近年来,随着单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)检测技术的发展,以SNP作为遗传图谱定位糖尿病易感基因的研究已经得到了广泛的关注。目前报道的与2型糖尿病相关的易感基因SNP位点已近百个,但其基因型与临床表型之间的关系尚不十分清楚,明确两者之间的相关性可以很好的为2型糖尿病的早期诊断和临床防治奠定基础。现已建立了很多种检测SNP位点基因型的方法,综合技术的可靠性、操作的简便性、仪器的精密性、筛选的通量性等原因都没能应用于临床检测,因此临床中需要一种成本低廉、操作简单、高通量性等优点的2型糖尿病易感基因SNP位点的检测方法。 连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)技术是在较高温度下,耐高温的连接酶可以对SNP位点进行识别,当SNP位点上下游探针与待测DNA模板完全互补,并且两条探针之间没有空隙时,进行连接反应;而当基因突变使探针序列与DNA模板存在碱基错配时,连接反应则不能进行。不同SNP基因型所对应的探针长度不同,并且探针末端带有荧光标记,根据DNA测序原理通过荧光扫描扩增片段的长度,不同的SNP基因型会在相应的片段长度处产生荧光发射峰,根据荧光发射峰位置的差异,进行SNP位点基因型的判定。多重LDR技术即是在LDR原理的基础上,在同一检测体系中同时加入多个待测SNP位点的探针,能够同时进行多个SNP位点基因型的检测。虽然目前LDR检测技术的发展应用已经较为成熟,但仍需要DNA测序等步骤,价格较为昂贵,不适用于大规模临床应用推广。 多色荧光编码微球(Multicolor encoded Fluorescent Microspheres,MFMs)的应用发展,为高通量检测技术开辟了更为广阔的空间。与传统有机染料相比,荧光纳米材料发光强度更强、稳定性更高,非常适合应用于生物荧光标记研究,多色荧光编码微球同时还具有生物相容性好、荧光性质优异等特点,作为可与各种生物分子相偶联的标记分子,尤其适用于多种生物大分子的高通量同步分析。特别是随着纳米材料表面修饰及其生物链接技术的成熟,更加促进了其在生物医学领域的进一步应用。应用多色荧光编码微球,可以使寡核苷酸探针在有限的长度范围内拥有更多颜色的组合形式,从而增加了在同一反应体系中同时检测更多SNP位点的能力。 磁性纳米粒子(Magetic nanoparticls,MNP)在生物医学领域的应用范围非常广泛,利用磁性分离技术可以实现对生物分子的快速分离纯化。通过分子修饰技术,可以在磁性纳米粒子表面修饰各种功能基团,使其具有同偶联的生物大分子相同的特性。利用功能化磁性粒子表面配体-受体之间特异性作用,可以快速、有效地实现对DNA产物的纯化,该方法操作简单,不需要凝胶电泳回收等步骤,而且可以在后续实验步骤中随时快速提取纯化的产物。 本课题应用连接酶检测反应技术、磁性纳米微粒高效纯化技术以及荧光编码微球标识技术的结合,对2型糖尿病四种易感基因SNP位点进行了检测,为分子病因学以及临床防治的结合建立了一种新型的检测技术。 本研究分四个部分:1、LDR法检测SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因SNP位点及其与T2DM的关系。应用LDR技术对T2DM患者的4个易感基因SNP即SLC30A8基因rs13266634位点、CDKN2A/2B基因rs10811661位点、HHEX基因rs1111875位点以及TCF7L2基因rs7903146位点基因型进行检测,在中国东北汉族人T2DM患者及正常人群中的分布频率进行分析,并以DNA测序法为标准印证LDR检测结果的准确性,同时探讨SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX和TCF7L2基因多态性与T2DM发病的相关性,以及其与糖代谢、脂代谢及慢性并发症之间的关系。2、磁性纳米微粒及荧光编码纳米微球的合成、修饰及其与DNA的偶联。应用共沉淀法制备了SiO2包覆的Fe3O4纳米粒子,并通过调控聚集体的大小和二氧化硅壳层厚度控制最终粒子的粒径和磁含量,得到SiO2基磁性纳米微球。通过共价偶联法、静电吸附法和聚电解质桥梁法等方法制备了4种染料掺杂的SiO2荧光纳米微球,即多色荧光编码微球。分别在磁性和荧光纳米微球的表面进行羧基修饰并与链霉亲和素偶联,制备成具有与生物大分子连接能力的SiO2基磁性及荧光纳米微球-链霉亲和素复合物。然后将其分别与5’端经生物素修饰的LDR上游探针、3’端经生物素修饰的LDR下游探针进行偶联反应。3、多重PCR-多重LDR法检测SNP位点体系的优化。运用多重PCR和多重LDR的技术原理,根据SLC30A8基因rs13266634位点、CDKN2A/2B基因rs10811661位点、HHEX基因rs1111875位点以及TCF7L2基因rs7903146位点,设计PCR引物及LDR探针,同时以全血基因组DNA为模板优化反应体系,探索最适反应条件,建立一种应用多重LDR法检测T2DM易感基因SNP位点的最佳反应体系。4、基于荧光编码微球标识的T2DM易感基因SNP检测体系的建立。以全血基因组DNA为模板,应用经过优化的多重LDR技术,磁性纳米微粒偶联LDR上游探针,快速、特异的分离出多重LDR扩增产物,去除反应体系中未参加连接反应的下游探针,荧光纳米微球标记LDR下游探针,通过对不同颜色的荧光的接收,有效地提高LDR检测的特异性,增加在同一多重LDR反应体系中同时检测更多SNP位点的能力。建立一种基于纳米材料多重LDR技术的T2DM易感基因SNP检测体系。 本研究得到如下结论: 1、应用LDR技术成功的对113例2型糖尿病和107例健康者的SLC30A8基因rs13266634位点、CDKN2A/2B基因rs10811661位点、HHEX基因rs1111875位点以及TCF7L2基因rs7903146位点基因型进行检测。发现SLC30A8基因rs13266634位点C等位基因与空腹胰岛素分泌不足、胰岛功能衰竭、胆固醇增高、心血管并发症的发病率相关;CDKN2A/2B基因rs10811661位点T等位基因与胰岛β细胞功能受损,胰岛素分泌减少及微血管并发症的发病率相关,HHEX基因rs1111875位点G等位基因与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇增高及心血管并发症的发病率相关。 2、成功合成了链酶亲和素修饰的SiO2复合磁性纳米微球和多色荧光编码微球,并分别将磁性纳米微球与LDR上游探针成功偶联、多色荧光编码微球与LDR下游探针成功偶联,国内外首次成功制备了用于2型糖尿病易感基因高通量检测的荧光编码微球标记的寡核苷酸探针。 3、优化了多重PCR、多重LDR的反应条件,证明了适当增加反应体系中的MgCl2及dNTP浓度、调整各基因引物使用的比例、降低退火温度可以有效减少多重PCR中非特异性产物的产生、提高PCR产物含量;适当增加上游探针含量比例、减少探针使用量、降低退火温度有利于提高多重LDR的分辨率。为临床中2型糖尿病多个易感基因位点同时检测奠定了技术基础。 4、将多重PCR-多重LDR技术结合磁性纳米微粒高效纯化技术,同时利用4种荧光编码微球标记的寡核苷酸探针对T2DM易感基因位点进行基因型检测,国内外率先证实了多色荧光编码微球可以用于标记寡核苷酸探针进行LDR检测,建立了一种可同时检测4种T2DM易感基因SNP位点基因型的检测方法,为进一步进行T2DM易感基因SNP位点基因型高通量检测奠定了实验基础。 本研究结合了多重LDR检测体系的简便性、高通量性,磁性纳米微粒纯化技术的简便性、可重复性以及多色荧光编码微球的通量性等优点,建立了一种经济、简便、快速、高通量的T2DM易感基因SNP位点基因型的检测方法,可以有效地降低检测成本,适合用于临床推广,可将生物病因学研究与临床防治有效对接。


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