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钙离子及水解酶在HIV-1 Vpu对宿主限制因子Tetherin拮抗过程中的作用研究

朱迎紫  
【摘要】:Tetherin(BST2,CD317)是一类天然宿主限制因子,可由干扰素α诱导表达。Tetherin具有广谱的抗病毒功能,能够抑制多种包膜病毒从宿主细胞中释放,而此功能依赖于其特定的拓扑和空间结构。Tetherin是一种II型膜蛋白,其整体结构由N端胞浆区(CT)、单次穿膜螺旋区(TM)、胞外螺旋区,C端糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol,GPI)锚定区构成。为了拮抗Tetherin对病毒释放的束缚作用, HIV-1通过编码Vpu蛋白帮助新生病毒粒子顺利脱逃。Vpu是HIV-1特有的I型膜蛋白,包含一段较短的胞外区,一段由α单股螺旋穿膜区,一段双股α螺旋胞内区。HIV-1Vpu对宿主限制因子Tetherin的拮抗作用对于HIV-1新生病毒粒子的顺利出芽和释放十分重要,但其通过何种机制拮抗Tetherin的作用尚不明确。这几年国际上对此问题的报道是逐步深化的,开始主要集中在Vpu对Tetherin的降解作用,随后进展为对Tetherin细胞表面定位的下调作用,但进一步的研究表明这二者都不是最主要的作用,Vpu对Tetherin的拮抗机制仍有待进一步阐明。 Vpu的同源寡聚体能够形成弱选择性钾离子通道,同时也有报道其可能干扰细胞的背景钾离子通道TASK的功能,但这类通道活性是否在促进释放和拮抗Tetherin方面具有作用仍不明确。Vpu具有离子通道活性,暗示其对细胞的膜电位以及胞内外的某些重要离子(如钙离子)的平衡可能有潜在影响。而Tetherin的物理系留作用使得我们和其他研究者们猜想Vpu可能通过激活某种形式的水解酶的活力来对Tetherin进行切割从而促进病毒释放。本论文在以上三个方面做了初步的探索性研究,为该研究领域提供了新思路。 本论文首先探究了Vpu的存在是否影响细胞内钙离子的浓度以及这种变化是否与Vpu自身的离子通道活性相关。我们在瞬时转染或稳定转染Vpu的细胞中利用钙荧光探针Fluo-4AM标记细胞内的钙离子,通过流式细胞术和倒置荧光显微镜镜检两种手段均检测到Vpu对细胞内钙离子浓度具有上调作用。 其次,本论文研究了细胞内钙浓度的变化是否会影响Vpu对Tetherin的拮抗作用,以及这一过程中是否有电压依赖钙离子通道的参与。荧光定量PCR结果显示,293T细胞和Hela细胞均能够内源性表达L型钙离子通道和T型钙离子通道相关亚基。利用RNA干扰和使用拮抗剂阻断钙通道等方法检测了VDCC对病毒释放的影响,结果表明,Vpu对Tetherin的拮抗作用可能与T型VDCC相关。此外,通过流式细胞术发现VDCC并不参与Vpu对细胞表面Tetherin表达量的下调过程。这些实验结果暗示Vpu可能通过T型VDCC调控细胞内钙离子浓度,而钙离子可能通过某些需要进一步研究的其他机制,如阻止Tetherin定位于病毒出芽位点或者激活某些水解酶类的方式,来拮抗Tetherin的功能。 此外,本论文探讨了一些可能作用于Tetherin的水解酶是否参与Vpu拮抗Tetherin过程。通过添加不同水解酶抑制剂的方法检测各类水解酶对HIV-1病毒释放的影响,证实了Vpu对Tetherin的拮抗作用与磷脂酶C、磷脂酶D和MMP不具有直接相关性,但MMP可能促进HIV-1病毒释放。我们还发现Tetherin存在潜在的弗林蛋白酶作用位点,但通过对该位点进行点突变,观察到Tetherin突变体的蛋白条带没有发生迁移现象,我们基本排除了弗林蛋白酶作用于Tetherin的可能性。 通过以上实验,我们对这些可能参与Vpu拮抗Tetherin过程的调控分子进行了尝试性摸索。这些实验结果帮助我们对Vpu与Tetherin的相互作用机制有了更深入的了解,为我们今后的探索方向提供一定的借鉴。在未来我们将设计更精细的实验深入研究Vpu引起的胞浆钙浓度的提升是否能够调控Vpu对Tetherin的拮抗过程,以及T型VDCC在这个过程中所发挥的作用。此外,初步探究Vpu对Tetherin的拮抗作用是否与膜曲率变化相关。通过这些探索性实验,尝试发现钙离子与Vpu/Tetherin作用途径的潜在关联并揭示一条新的依赖钙离子的Vpu对Tetherin的拮抗途径。


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