核盘菌bZIP转录因子Ss-Adal的功能研究

【摘要】：核盘菌（Sclerotinia Sclerotiorum (lib.) de Bary）是一种危害十分严重的植物病原真菌，其寄主范围广，可侵染75科278属450多种植物引起菌核病，其中以大豆、油菜、向日葵等油料作物菌核病的发生最为严重。bZIP转录因子是在真核生物中广泛存在的一类转录因子，调控特定基因的时空表达，并参与生物体内多种生理进程。bZIP转录因子Ada-1是Dunlap课题组在对模式真菌粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）编码基因进行系统敲除过程中发现的，已被研究证实对粗糙脉孢霉的生长发育及有性生殖过程具有调控功能，但在核盘菌中该转录因子的功能尚未被揭示。因此在核盘菌中对该转录因子的功能进行研究，能够从分子水平上加深对核盘菌生长发育过程的了解，为核盘菌的防治提供科学依据和理论支持。 1.本研究根据已在粗糙脉孢菌中鉴定的转录因子Ada-1（NCU00499）的氨基酸序列在核盘菌基因组网站中进行BlastP分析，发现核盘菌中存在与其氨基酸序列同源性高达54.57%的未知蛋白，将该蛋白命名为SsAda-1（SS1G_01411.3）。核盘菌中该蛋白的编码基因SsAda-1（Transcript:SS1G_01411T0）位于基因组第1条染色体，大小1917bp，包含54bp的内含子，ORF能编码621个氨基酸。在NCBI中对核盘菌转录因子SsAda-1蛋白质结构进行分析发现该蛋白含有保守的碱性DNA结合区域，ClustalX对氨基酸序列同源性分析可知SsAda-1保守功能域与粗糙脉孢霉中Ada-1的bZIP DNA结合域同源性更是高达95%，二者都属于bZIP转录因子家族。 2.本研究根据SsAda-1基因在核盘菌基因组中的位置，查找其上下游序列，设计特异引物，以核盘菌DNA为模板克隆SsAda-1基因上游1041bp片段，下游1488bp片段，将上下游片段分别与真核敲除载体pXEH连接，构建核盘菌SsAda-1基因敲除载体，为下一步转化核盘菌原生质体获得SsAda-1基因敲除突变体奠定了基础。 3.本研究使用Lysing酶解核盘菌菌丝制备原生质体，通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将已构建好的敲除载体转化到核盘菌原生质体中。使用PCR扩增及Southern杂交对经过潮霉素筛选的转化子进行验证。对核盘菌SsAda-1基因敲除突变体进行生物学特性及致病性的分析：与野生型菌相比， SsAda-1基因敲除突变体生长速度明显减慢，仅能形成S1期菌核而不能向更成熟的阶段发育；显微观察结果表明敲除突变体菌丝分支角度变大，但能够形成正常的侵染结构；接种野生型番茄叶片进行致病性分析，结果显示SsAda-1基因敲除突变体致病性显著下降。Real Time PCR检测SsAda-1基因在核盘菌不同生长阶段的表达动态，结果表明SsAda-1基因在核盘菌S1期菌核阶段表达量最大，且显著高于其它各个时期，这与表型观察结果相一致。 本研究通过基因敲除、形态学观察及基因表达量分析的方法证明了核盘菌转录因子SsAda-1在核盘菌的生长发育及侵染过程中起着重要作用，尤其是对菌核的形成和发育。与在粗糙脉孢霉中的研究结论不同，本研究揭示了转录因子Ada-1在核盘菌中可能存在新的功能即调控菌核的形成及发育。