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大豆DREB/CBF转录因子GmDREB1A的克隆及功能鉴定

李艳杰  
【摘要】:大豆(Glycine max L.)是重要的粮食和油料作物,是植物蛋白和食用油的主要来源,也是重要的家畜饲料和工业原料。然而,干旱、盐碱和低温等胁迫因子对大豆的生长发育和产量产生了严重的影响,也给大豆的农业生产造成了巨大的损失,因此,培育和种植抗寒性、抗旱性、耐盐碱的大豆新品种是实现继续提高大豆产量和生产可持续发展的途径之一。分子生物学及遗传分析表明,转录因子参与多个胁迫相关基因的表达,随着分子生物学的迅速发展和植物基因工程技术的成熟,通过转录因子进行遗传改造,对大豆抗逆机制进行深入研究,克隆抗逆相关基因,对于提高大豆的抗逆性,促进大豆的生产具有重要的意义。本研究从大豆品种吉林32中克隆了一个新的DREB/CBF转录因子GmDREB1A,并对其结构和功能进行初步分析,主要研究结果如下: 1.利用RT-PCR方法从大豆品种吉林32中分离出一个新的DREB/CBF转录因子基因。GmDREB1A的ORF全长为957bp,编码318个氨基酸残基,预测蛋白分子量为35.57kDa,含有一个AP2/ERF结构域,在线软件预测其编码的蛋白定位在细胞核中,氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明该基因属于DREB/CBF转录因子的A-6亚类。 2.将GmDREB1A进行原核表达,SDS-PAGE电泳结果表明GmDREB1A蛋白能在原核系统中高效表达; 3.通过酵母单杂交对GmDREB1A的转录激活活性进行分析,实验表明GmDREB1A在酵母中具有转录激活能力,为转录激活子; 4.通过Overlapping PCR技术获得GmDREB1A::eGFP融合基因,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,对其进行亚细胞定位分析,结果表明GmDREB1A定位于细胞核中; 5.利用real-time PCR对GmDREB1A基因的组织表达特性及逆境诱导表达特性进行分析,结果表明,GmDREB1A在大豆各组织中均有表达,不具组织表达特异性;GmDREB1A基因对高盐、干旱、低温、机械伤害、ABA、SA这6种胁迫处理均存在不同程度的应答响应。 6.利用gateway技术将GmDREB1A构建到植物表达载体pCB35SR1R2-GFP,并转化农杆菌,利用农杆菌介导的浸花法将GmDREB1A基因转化拟南芥,获得T3代转基因拟南芥植株。对转基因拟南芥进行高盐和干旱等逆境胁迫分析,并对其相关生理指标进行测定,研究结果表明,GmDREB1A基因的过表达,提高了转基因拟南芥对高盐及干旱胁迫的抗性。


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