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大豆抗氧化活性肽的生物制备技术及稳定性研究

刘丹  
【摘要】:本研究来源于国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD33B03)——“食源性功能肽生物制备技术研究”的一部分。本论文以大豆浓缩蛋白粉为原料,采用微波辅助酶解技术、超滤分离技术、葡聚糖凝胶纯化技术,结合基于不同机理的体外抗氧化活性的化学测定方法和基于H2O2引起的体外培养HEK-293完整细胞的氧化损伤保护作用的方法,制备大豆抗氧化活性肽,并对大豆抗氧化活性肽的稳定性进行了深入研究。获得了以下的主要结论: (1)采用Alcalase碱性蛋白酶微波辅助酶解大豆浓缩蛋白粉,通过单因素和响应面相结合的实验优化方法,以ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率、还原力作为评价指标,得到制备大豆抗氧化活性肽的最优酶解工艺参数为:微波辅助酶解时间37min、酶解温度56℃、pH值8.17、加酶量5:100、底物浓度50mg/mL、酶解功率500W。 (2)通过对大豆抗氧化活性肽的稳定性研究可以得到:大豆抗氧化肽在25-60℃的较低温度范围内,活性保持率比较高,而当温度达到80℃时,活性保持率明显降低,且处理时间越长,活性损失越大。强酸环境和强碱环境对抗氧化活性肽的抗氧化活性均有影响,且强碱环境的影响更明显,在pH值为6、7、8时活性保持率较好。添加质量分数为0.5%-5.0%的NaCl对大豆抗氧化肽溶液的活性影响不明显;添加质量分数为1.0%-8.0%的葡萄糖,大豆抗氧化活性肽溶液的抗氧化活性明显下降;添加质量分数为0.04%-0.20%的柠檬酸,对ABTS自由基清除活性影响不明显,而较低质量分数的柠檬酸会增强大豆抗氧化活性肽羟基自由基清除活性,较高质量分数的柠檬酸会抑制羟基自由基清除活性。金属离子对大豆肽溶液的抗氧化活性影响较大,Zn2+对ABTS自由基清除率的影响最明显,Ca2+对羟基自由基清除率的影响最明显,而K+对二者的影响均相对来说较小。胃肠道消化酶对大豆肽抗氧化活性影响较大。 (3)Alcalase碱性蛋白酶微波辅助酶解大豆浓缩蛋白粉得到的酶解液通过1kDa、3kDa、10kDa、30kDa的超滤膜截留后,得到SAP-I,SAP-II,SAP-III,SAP-IV,SAP-V五个组分,其得率分别为19.53%、4.28%、17.12%、31.46%、27.61%。以DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、亚铁离子螯合率、还原力、抑制亚油酸的自动氧化能力为指标,综合评价以上的五个组分和混合组分的体外抗氧化活性。综合考虑各组分的得率和体外抗氧化活性,选择SAP-IV(分子量1kDa-3kDa)、SAP-V(分子量1kDa)两个较优组分进行后续进一步的纯化以及细胞保护研究。 (4)将SAP-IV、SAP-V两个组分经过葡聚糖凝胶G-25进行分离纯化,在最大吸收波长280nm监测条件下可以得到F1、F2、F3、F4、F5、F6六个组分,六个组分均在浓度低于1000μg/mL对HEK-293细胞没有毒性,F5组分对H2O2诱导HEK-293细胞氧化损伤的保护效果最好。可以作为大豆抗氧化肽目标组分进行后期更加深入的研究。


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