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林蛙皮多肽提取工艺的建立及其对HaCaT细胞作用的研究

张鑫  
【摘要】:多肽具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种活性。部分多肽与皮肤细胞的增殖有关,能提供皮肤养分,延缓皮肤衰老,促进皮肤创面修复,具有重要的应用价值和开发潜力。林蛙皮腺内含多肽类因子、保湿因子等多种活性物质,林蛙皮多肽以其抗菌、抗病毒活性而备受研究者青睐。 本实验采用酸浸提法、中性蛋白酶水解法分步提取林蛙皮多肽,以多肽得率为指标,分别进行单因素、L9(34)正交实验,得出酸浸提林蛙皮多肽液的最佳工艺:4℃条件下,pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液、料液比1:30、浸提时间12h;酶解法提取林蛙皮多肽液的最佳工艺:料液比:1:2,温度55℃、pH6.5、时间2h、加酶量1000U/g。在最优工艺下,分别将反应体系放大1000倍。酸浸提多肽粗提液,用膜分离技术分级分离,得到纳滤浓缩液进行真空冷冻干燥,制得林蛙皮酸浸提多肽APR(Acidolysis-polypeptides from skin ofRana)冻干粉;然后将酸浸提后的残渣及超滤浓缩液,利用优化的酶解条件制备酶解多肽粗提液,膜分离技术分级分离得到纳滤浓缩液,真空冷冻干燥制得林蛙皮酶解多肽EPR(Enzymolysis-polypeptides from skin of Rana)冻干粉。检测APR和EPR干粉的理化性质,结果显示,在220nm处有多肽的紫外特征吸收峰、傅里叶红外光谱检测有多肽的特征官能团、高效凝胶过滤测得多肽相对分子量范围为190Da~1000Da。表明成功制备两种林蛙皮多肽干粉。 MTS法检测APR和EPR对HaCaT细胞的增殖作用,结果显示,当APR和EPR在800mg/L、1600mg/L浓度时(后文用APR800、EPR800表示)对HaCaT细胞增殖均有促进作用(p0.001)。实时荧光定量PCR分析HaCaT细胞表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)mRNA的相对表达量,与空白对照组相比APR800、EPR800作用的HaCaT细胞EGF mRNA的相对表达量分别升高0.24倍(p0.05)、0.4倍(p0.001)。 Western blotting检测HaCaT细胞EGF蛋白的表达水平,与空白对照组相比APR800、EPR800作用的HaCaT细胞EGF蛋白的相对表达量分别升高1.1倍(p0.05)、1.48倍(p0.01),表明林蛙皮多肽促进HaCaT细胞的增殖与细胞EGF蛋白质表达量的增加有关。 检测APR、EPR对HaCaT细胞中CAT、SOD、Hyp、MDA和T-AOC含量的影响,结果显示,与空白对照组相比,实验组CAT、SOD、Hyp含量和总抗氧化能力T-AOC升高(p0.001),丙二醛含量下降(p0.05);表明APR、EPR均具有抗氧化活性。流式细胞术-Annexin V-FITC/PI双染法检测APR、EPR对HaCaT细胞凋亡(率)的影响,结果显示,APR800、EPR800作用后的HaCaT细胞凋亡率分别降低2.3%(p0.001)、1.3%(p0.001),且正常细胞百分率增大。荧光定量PCR和Western blotting检测HaCaT细胞中半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)mRNA和蛋白质的相对表达量,结果显示,APR800和EPR800作用的HaCaT细胞Caspase-3mRNA的相对表达量分别下降2.5倍(p0.05)、4.9倍(p0.001);Caspase-3蛋白质的相对表达量分别降低1.4倍(p0.01)、1.2倍(p0.01),表明林蛙皮多肽能抑制HaCaT细胞的凋亡,且与Caspase-3凋亡途径有关。 本研究利用酸浸提工艺,保留了林蛙皮多肽特有的活性;酶水解工艺将酸浸提残渣内的大分子蛋白酶解成多肽。膜分离技术、真空冷冻干燥技术最大限度保留了多肽的活性,且规模易于放大。同时初步探究APR、EPR对HaCaT细胞增殖、凋亡的作用及机制,为研究林蛙皮多肽对皮肤细胞的作用奠定理论基础。


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