人参皂苷微波辅助降解产物及其生物活性研究

【摘要】：人参皂苷是五加科人参属植物（人参、西洋参、三七等）的主要药效成分，具有增强免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、抗缺氧、抗衰老、降血糖等多种药理作用。人参皂苷可分为常见人参皂苷和稀有人参皂苷，其中常见人参皂苷是指在人参属植物中含量较高、分离纯化相对容易的人参皂苷，主要有原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和原人参三醇型人参皂苷Re、Rg1、Rg2等。稀有人参皂苷多为常见人参皂苷脱去部分糖基或侧链结构改变的次级人参皂苷，这些皂苷在人参属植物中含量极低或不存在，主要有人参皂苷Rh1、Rh2、Rh3、Rg3、Rg5、Rg6、Rk1、Rk3、Rh4、F4、c-k等。近年来人们在稀有人参皂苷的生物活性研究方面取得了很大进展，在抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳以及清除自由基等生物活性方面，发现了稀有人参皂苷比常见人参皂苷具有更高的药理活性。 随着稀有人参皂苷新的生物活性不断被发现，如何快速、高效的获得稀有人参皂苷成为目前人参皂苷研究的热点之一。传统的提取分离方法只能获得常见人参皂苷，通过酸降解、碱降解、酶降解、高温高压降解等方法可将常见人参皂苷转化成稀有人参皂苷，但这些方法均存在产率低、分离纯化困难等缺点，因而难以获得大量高纯度稀有人参皂苷单体。 微波应用于中药有效成分的提取，在提高提取效率的同时还为实验体系带来非致热效应。在微波电磁场的作用下，体系内物质的分子会发生极化现象，同时振动和转动频率加快，使分子处于极为活跃的亚稳状态，易于发生较弱化学键的断裂和化学键重新组合。此外，分子热运动的加剧也会增加分子间的有效碰撞频率，促进化学反应速度。因此，微波提取样品过程中易于发生化学成分的结构转变。人参皂苷类成分糖苷键以及母核侧链中的部分化学键属于相对较弱的化学键，易于发生断裂和重组。因此，利用微波技术可加速实现常见人参皂苷向稀有人参皂苷的转变。 本文深入研究了微波对西洋参以及7种常见人参皂苷单体的辅助降解作用及其降解机制，同时对获得的降解产物的抗氧化以及降血糖生物活性进行研究，并与传统提取方法获得的提取物进行了对比研究。 本文首先利用高效液相色谱法对西洋参微波降解产物中的9种稀有人参皂苷（20(S)-Rh1，20(R)-Rh1，Rg6，F4，Rk3，20(R)-Rg3，20(S)-Rg3，Rk1和Rg5）进行了定性定量分析，并以这些稀有人参皂苷的产率作为指标考察了最佳微波辅助降解条件。考察因素包括溶剂组成、物料比、反应温度、反应时间、微波功率等。当纯水作为提取溶剂、物料比1:40、微波功率1600w、温度145℃条件下持续降解15min时，稀有人参皂苷的产率达到最高。此外，将微波辅助降解与传统加热回流提取法进行了对比研究，结果发现微波对常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化具有非常明显的促进作用。在微波辅助降解条件下西洋参中的常见人参皂苷全部降解为稀有人参皂苷，而利用传统的加热回流提取法提取时基本不发生常见人参皂苷向稀有人参皂苷的转化。 另外本文采用最佳微波辅助降解条件对7种常见人参皂苷单体（Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Re和Rg1）进行了微波辅助降解，得到了各单体的降解产物，并与相同条件下不加微波辅助的高温高压降解产物进行了对比研究。结果发现，微波对常见人参皂苷单体向稀有人参皂苷转化具有明显的促进作用。 在上述研究的基础上，本文总结了常见人参皂苷经微波辅助降解后转化为稀有人参皂苷的变化规律。结果表明，原人参二醇型常见人参皂苷单体微波降解产物中稀有人参皂苷Rg5的含量最高，其他稀有人参皂苷含量的高低顺序为Rk1＞20(R)-Rg3＞20(S)-Rg3。原人参三醇型常见人参皂苷的微波降解产物之间略有区别：尽管人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的微波降解产物中稀有人参皂苷Rh4的含量均最高，但其他稀有人参皂苷含量的高低顺序人参皂苷Re为Rh4＞Rk3＞F4＞20(R)-Rh1≈20(S)-Rh1＞Rg6；人参皂苷Rg1为Rh4＞Rk3＞20(R)-Rh1＞20(S)-Rh1。 本文还对西洋参以及各种常见人参皂苷单体的微波降解产物和它们的非微波降解产物进行了生物活性对比研究。 利用2-2’-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）诱导红细胞溶血实验模型，研究了西洋参微波降解产物、传统方法提取物以及7种常见人参皂苷单体的微波降解产物及非微波高温高压降解产物对自由基诱导的人血红细胞氧化性溶血的保护作用。结果表明，在较低浓度下，西洋参的微波降解产物以及其他各种提取物对自由基诱导的人血红细胞氧化性溶血均有一定的保护作用，其中西洋参微波降解产物活性最高，具体抗氧化活性顺序为：微波降解产物高温高压降解物甲醇回流提取物水煎煮提取物。但在较高浓度下，上述降解产物或提取物均表现出促进红细胞溶血的作用。7种常见人参皂苷单体微波降解产物的抗溶血活性关系为RdRcRb3Re~Rg1Rb2~Rb1；而上述7种常见人参皂苷单体的非微波高温高压降解产物的抗溶血活性关系为Rg1ReRdRb1~Rb2~RcRb3。对比各人参皂苷单体的微波降解产物和高温高压降解产物，在浓度较低时，微波降解产物的抗溶血活性均高于高温高压降解产物；浓度较高时，高温高压降解产物则表现出更好的抗溶血活性。 本文还通过测定对二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）活性的抑制作用，研究了常见人参皂苷单体的微波降解产物、常见人参皂苷单体的非微波高温高压降解产物、西洋参及西洋参叶的微波降解产物、西洋参及西洋参叶的非微波高温高压降解产物、西洋参的传统方法提取物等31种样品的降血糖作用。结果表明，常见人参皂苷单体未表现出DPP-Ⅳ抑制活性，但常见人参皂苷的微波降解产物及高温高压降解产物则表现出了一定的DPP-Ⅳ抑制效果。西洋参的甲醇、乙醇提取物对DPP-Ⅳ有一定的抑制作用，但西洋参的微波辅助降解提取物和高温高压非微波提取物对DPP-Ⅳ没有明显的抑制效果。在31种实验样品中对DPP-Ⅳ有较为明显的抑制效果的样品分别为人参皂苷Rc、Rd的微波降解产物和人参皂苷Rb2、Rc的高温高压降解产物。 综上所述，本文研究的结果表明，微波辅助降解是将常见人参皂苷降解为稀有人参皂苷的有效方法，采用微波辅助降解得到的稀有人参皂苷，具有更好的清除自由基和降血糖的生物活性。研究结果还表明，对人参属植物进行微波辅助提取或对人参皂苷单体进行微波辅助降解能够获得生物活性更高的提取物或降解产物。同时本文的研究结果也为采用微波辅助降解手段从传统中药材中获得更高生物活性的提取物或化学成分提供了新的研究思路与研究方法。