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miR-375/499在猪睾丸组织不同发育阶段表达研究及靶基因验证

张晓军  
【摘要】:MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性非编码序列,广泛地存在于多种组织和器官中,通过降解mRNA或阻碍其翻译的方式调节靶基因,从而实现对生命体重要的调控作用。有研究表明,miRNAs在睾丸组织中也有表达,并且对曲细精管的发育及精子成熟都有重要的调控作用。miR-375和miR-499是经过前人高通量测序鉴定出在军牧1号白猪1月龄睾丸组织和6月龄睾丸组织中存在差异表达的两个miRNAs,因此本研究针对miR-375和miR-499在1日龄,1-7月龄睾丸组织中的表达水平进行检测,并且对它们的靶基因进行验证。 首先观察了1日龄,1-7月龄的军牧1号种公猪睾丸组织形态。结果表明,随月龄增大,睾丸组织中曲细精管管腔逐渐增大,同一视野下,曲细精管数目逐渐减少,并且曲细精管管腔之间的结缔组织也逐渐减少,管腔中的支持细胞和精母细胞逐渐向基底膜靠近。 与此同时,对不同月龄睾丸组织中生物信息学预测的miR-375可能的靶基因DIAPH2, YAP1, YBX1, ITPKB和NR5A2,miR-499可能的靶基因CYLC1, DMRT1,QKI, XRN2和ZNF313进行了实时荧光定量检测。结果表明,miR-375在1日龄,1-3月龄睾丸组织中表达量均较低,4月龄表达量有所增加,4-7月龄呈现显著上调趋势。miR-499在1日龄到2月龄表达量呈上调趋势,然后2-7月龄呈下调趋势,2月龄表达量最高,7月龄表达量最低。而miR-375和miR-499的靶基因在不同发育阶段睾丸组织中均存在差异表达,并且经SPSS13.0分析可知,miR-375和靶基因DIAPH2存在显著负相关,miR-499和靶基因QKI存在显著负相关。 然后对miR-499的靶基因QKI在不同月龄睾丸组织中蛋白水平的表达量分析。经蛋白免疫印迹研究表明,QKI基因在1日龄表达量比1-4月龄表达量高,1-4月龄表达量相对较低,但5-7月龄时表达量较高。结果可知,QKI基因在后期睾丸组织中表达量较高。 然后利用双荧光素酶报告基因法验证miR-499及QKI的靶标关系,首先利用3’RACE技术扩增了QKI基因的3’UTR区,然后构建了QKI基因3’UTR的表达载体,干扰载体及空载体(pmiR-RB-REPORT-QKI-WT/si/mut)。将miR-499的模拟物及miRNA阴性对照与三种载体分别共转染后检测荧光值。结果显示,①阴性miRNA对QKI三种载体影响差异不大;②而miR-499对野生型QKI载体影响显著,显著低于miR-499和突变型及空载体组;③而突变型组及空载体组之间的荧光值差异不显著。说明,QKI基因的3’UTR区存在miR-499的靶位点。 经以上实验初步验证后,构建miR-499的过表达载体转染猪睾丸细胞系后经荧光定量检测可知,①过表达的miR-499组相对于阴性对照组和空白组,miR-499的表达量显著高于阴性对照组及空白组,而空白组与阴性对照组无显著差异;②利用荧光定量检测靶基因的表达量显示,过表达miR-499组的QKI基因表达量显著少于空白组及阴性对照组中的QKI基因的表达量;③并且免疫印迹实验显示,过表达miR-499组QKI的蛋白表达量显著低于阴性对照组及空白组,而空白组与阴性对照组无显著差异。以上实验结果与睾丸组织发育切片结合,推测不同发育阶段的miR-375/499及其各自的靶基因的差异表达可能和睾丸组织发育程度有关。


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