CRISPR/Cas9技术介导兔先天性白内障疾病模型构建及表征分析

【摘要】：先天性白内障是一种严重的致盲性眼病,是导致儿童失明的主要原因。据临床数据显示,约1/3的先天性白内障与遗传有关,且主要为常染色体显性遗传。晶状体蛋白和缝隙连接蛋白的异常表达均可引发先天性白内障。因此,本课题选择晶状体蛋白CRYAA基因和缝隙连接蛋白GJA8基因进行研究。其中由CRYAA基因编码的αA晶状体蛋白占晶状体蛋白的40%,在防止蛋白错误聚集方面起到重要作用。GJA8编码的Cx50蛋白主要功能为形成缝隙连接通道,使纤维细胞间代谢产物及水等物质交换,以维持晶状体发育及透明。不同的致病基因突变可能引起不同白内障症状并具有不同分子细胞发病机制,因此,明确白内障发病机理对于进行白内障相关治疗极为重要。鉴于兔眼睛大小与人类之间的相似性,我们选择兔作为人眼病模型。CRISPR/Cas9系统作为一种能够对基因组进行精准高效切割的新型基因编辑技术,具有设计周期短、实验费用低和打靶效率高等优点。因此,本课题利用CRISPR/Cas9技术,对兔CRYAA基因和GJA8基因进行靶向修饰,构建先天性白内障模型并进行表征分析。在本实验中,根据兔全基因组数据库提供的CRYAA及GJA8基因序列,针对这两个基因的编码框分别设计两对sg RNA。将体外成功转录并纯化的Cas9及sg RNA m RNAs,通过显微注射方式注入兔受精卵中,并进行胚胎移植。利用PCR、HE染色、western blotting、免疫组化及TUNEL等实验手段对F0代仔兔进行基因型及CRYAA、GJA8敲除兔的表型进行分析。结果表明,与野生型兔相比,CRYAA+/-兔表现为晶状体浑浊,CRYAA蛋白表达显著减少,晶状体上皮细胞凋亡增多。与野生型兔相比,GJA8+/-兔也表现为明显晶状体浑浊,并有小眼,小晶状体症状。Westernblotting检测发现,在敲除兔中GJA8蛋白表达量明显降低。免疫荧光结果同样证实,GJA8+/-兔晶状体皮质部GJA8蛋白表达明显减少。透射电镜技术研究发现,GJA8+/-兔缝隙连接通道变细变短。对F1代仔兔的检测和观察表明,上述两种先天性白内障表型均可稳定遗传。以上结果表明,CRYAA基因或GJA8基因突变可引起兔先天性白内障,并且具有典型白内障表型,能充分模拟人类白内障。该白内障模型将为CRYAA及GJA8基因功能研究开展、白内障药物筛选及研发发挥重要作用。