丁酸钠基于PKM2干预大鼠心肌缺血性损伤的研究

【摘要】：急性心肌缺血是冠状动脉急性、持续性闭塞所导致的,如不及时救治,将导致局部心肌坏死。其由于起病急、病情危重和病死率高,一直是中老年人猝死的主要原因。当前调查显示,我国急性心肌缺血发病率呈年轻化趋势,猝死率高,严重威胁着人们的生命与健康。目前急性心肌缺血的治疗以药物治疗为主,同时配合冠状动脉介入治疗等再灌注方法,但如何提高抗心肌缺血的治疗效果、减少不良反应及改善预后仍是当前面临的主要问题。丁酸钠作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,已经在多个领域有了广泛应用。丁酸钠能够抑制肿瘤细胞的增殖及促进肿瘤细胞的衰老、凋亡。这可能与丁酸钠调控组蛋白的乙酰化水平有关,并且丁酸钠在肿瘤领域的临床研究上已经得到应用。有研究报道,丁酸钠可保护急性缺血的心肌组织,而在心肌缺血保护和治疗方面研究的还不够深入,相关机制及信号通路并没有具体阐明。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)是糖酵解途径中的关键限速酶,能不可逆地催化其上游底物磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvic acid,PEP)生成丙酮酸,并生成一分子ATP。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)为PK的同工酶之一。PKM2在增殖的细胞中特别是肿瘤细胞中有高表达,其四聚体和二聚体形式之间的转换决定了葡萄糖转化成丙酮酸后是用于供能还是参与到生物合成的过程中。随着对其调节机制的深入研究,PKM2在肿瘤代谢方面的重要作用使其成为临床上肿瘤治疗的一个新的靶点,但近来其在心肌能量代谢方面的研究受到学者们的关注。本实验拟基于PKM2,寻找丁酸钠干预心肌缺血的保护作用机制。实验目的:本实验主要研究丁酸钠对心肌缺血损伤的保护作用,观察这种作用是否由调节PKM2表达及其活性产生;进一步探讨丁酸钠基于PKM2对心肌缺血时能量代谢的影响,研究丁酸钠基于PKM2对急性心肌缺血保护作用的机制。实验方法:构建心肌缺血大鼠模型,检测各组模型是否制备成功;检测丁酸钠各给药组是否对心肌缺血起到保护作用。应用westernblot实验检测pkm2在急性心肌缺血后1d、2d、3d及7d的表达情况,从而确定在心肌缺血过程中pkm2表达量的动态变化;采用western技术检测pkm1、pkm2在正常组织和缺血心肌组织中蛋白表达量的变化,从而观察在心肌缺血损伤中pkm1与pkm2的相互关系;再给予pkm2特异性抑制剂紫草素后,检测血清心肌酶、mda含量、sod活性及相关蛋白表达,以确认丁酸钠对心肌缺血损伤的保护作用是否通过pkm2实现的。采用免疫荧光实验,观察给予丁酸钠对pkm2表达的影响;采用丙酮酸激酶活性试剂盒,检测丙酮酸激酶活性,进而观察在急性心肌缺血后不同时间点pkm2活性的变化情况;应用三磷酸腺苷(atp)含量试剂盒,检测给予丁酸钠后对atp含量的影响。实验结果:实验发现,丁酸钠减少心肌缺血大鼠心肌梗死面积,降低血清心肌酶ast、ck、ldh,减少mda含量,升高sod活性。通过westernblot实验发现,心肌缺血后1、2、3和7天pkm2的表达量增加;采用westernblot技术与免疫荧光技术发现,给予丁酸钠增加缺血心肌组织pkm2的表达,以2天组表达量最高,提示丁酸钠可能促进心肌缺血后pkm2的表达。实验发现,丁酸钠能提高心肌缺血大鼠丙酮酸激酶活性,增加atp含量。选用pkm2的特异性抑制剂紫草素发现,紫草素能拮抗丁酸钠对心肌梗死面积的影响,以及丁酸钠对ck、ast、ldh的作用,提示给予紫草素抑制pkm2后心肌损伤程度加重。通过westernblot实验发现,给予抑制剂紫草素后下调心肌组织中pkm2的表达,减弱了丁酸钠增加pkm2表达的作用,提示丁酸钠对急性心肌缺血的保护作用有pkm2的参与。实验结论:1.丁酸钠降低心肌缺血大鼠梗死面积,对大鼠急性心肌缺血性损伤有保护作用。2.缺血大鼠心肌组织中pkm2表达增加,且在缺血后的第二天最明显。3.丁酸钠能够上调pkm2的表达,增强其活性,增加atp的含量。4.pkm2抑制剂紫草素能部分拮抗丁酸钠的作用,提示丁酸钠对缺血心肌的保护作用部分通过调控pkm2来实现的。