Omi/HtrA2裂解线粒体融合蛋白OPA1诱导脑缺血再灌注细胞凋亡的机制

【摘要】：背景:脑缺血引起的脑神经细胞损伤机制依然是人们关注的重点。目前发现,某些蛋白在生理与病理过程中的作用不一致甚至截然相反。Omi/Htr A2是一种丝氨酸蛋白酶,在线粒体中发生剪切,使其具有酶活性,存于线粒体间隙,线粒体通过未折叠蛋白反应清除错误折叠蛋白,而线粒体应激主要表现在线粒体内未折叠蛋白的增加,Omi/Htr A2具有分子伴侣功能,参与了线粒体应激反应,此时具有一定的神经保护作用。当在某些应激条件下被释放到胞浆后与抑凋亡蛋白XIAP结合,并抑制XIAP与caspase9的结合,激活caspase9导致下游caspase3途径的活化,引起细胞凋亡。而线粒体融合蛋白OPA1定位于线粒体内膜,促进线粒体的网络融合,参与了线粒体嵴形态的维持,并在细胞凋亡中发挥了重要的作用。因此,明确具有双重作用的Omi/Htr A2在脑缺血再灌注细胞损伤中作用机制以及其与OPA1之间的关系可以为脑缺血再灌注损伤的临床诊断治疗提供新的思路和靶点。目的:采用线栓法复制大鼠大脑中动脉阻塞模型与PC12氧化应激损伤模型,从体内外探讨Omi/Htr A2通过影响OPA1诱导神经元损伤的作用机制。方法:1.体内实验:Wistar大鼠,随机为4组:假手术组、缺血1h再灌24h组,缺血1.5h再灌24h组,缺血3h再灌24h组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。苏木精-伊红(HE)染色法检测大鼠大脑损伤情况;Western Blot的方法检测相关凋亡蛋白caspase3及丝氨酸蛋白酶Omi/Htr A2的表达情况。2.体外实验:采用强氧化剂H2O2复制大鼠嗜铬细胞瘤细胞株p Heochromocytoma cells(PC12细胞)氧化应激损伤模型,并使用Omi/Htr A2特异性抑制剂ucf-101抑制Omi/Htr A2活性作为治疗组。将细胞分为4组,即con组、H2O2组,H2O2与ucf-101合加组,ucf-101单加组。PC12细胞给药后继续培养6h。1)MTT检测不同浓度H2O2对PC12细胞生存率的影响。2)Western blot方法检测不同浓度H2O2对PC12细胞Omi/Htr A2及凋亡蛋白Caspase9,、cleaved caspase3表达水平变化的影响。3)显微镜下观察H2O2对PC12细胞形态的变化的影响,台盼蓝染色的方法计算PC12细胞生存率。4)Western Blot检测给予Ucf-101后,cleaved caspase3、线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/Htr A2、XIAP、线粒体应激相关蛋白Clp P,CHOP及线粒体内膜融合蛋白OPA1裂解情况及表达水平的变化。5)采用Mito-tracker染色检测PC12细胞线粒体形态变化;采用JC-1染色方法检测PC12细胞中线粒体膜电势的变化。6)免疫共沉淀检测Omi/Htr A2与OPA1之间的相互作用。结果与讨论:体内实验证明,随着缺血时间的延长,大脑皮质神经细胞损伤加重。损伤侧大脑皮质凋亡蛋白cleaved caspase3表达逐渐增强,Omi/Htr A2的表达水平随着凋亡的增强而增强,与凋亡情况呈正相关,说明Omi/Htr A2可能参与了缺血再灌注导致的脑损伤。在体外实验中,H2O2能够降低PC12细胞的存活率,而给予Omi/Htr A2抑制剂Ucf-101,可以明显抑制由H2O2诱导的细胞生存率降低。Western blot结果显示,H2O2可以明显增加凋亡相关蛋白Caspase9、Caspase3的表达,同时Omi/Htr A2的表达明显增加,通过裂解XIAP加重凋亡。当用Ucf-101抑制Omi/Htr A2活性时,Omi/Htr A2裂解XIAP的能力下降,PC12细胞凋亡水平明显降低,说明Omi/Htr A2参与了氧化应激诱导的细胞凋亡。Mitotracker染色结果表明,H2O2可以使PC12细胞的线粒体呈点状聚集,说明此时线粒体分裂融合受限,以分裂状态为主。JC-1染色结果表明,H2O2使PC12细胞绿色荧光强度明显增强,膜电势明显下降。当使用Ucf-101特异性抑制Omi/Htr A2的活性后,线粒体呈点状聚集减少,线粒体的膜电势回升,说明Omi/Htr A2通过影响线粒体形态的改变,参与线粒体膜电势的调控。H2O2还可使线粒体应激反应相关蛋白Clp P、CHOP表达增强,当Omi/Htr A2的活性被抑制后,线粒体应激反应减弱,说明Omi/Htr A2可能也参与了线粒体应激的调控。当PC12细胞受到氧化应激损伤时,OPA1被裂解,由L-OPA1转变为S-OPA1,S-OPA1表达明显增加。而当使用Ucf-101抑制Omi/Htr A2活性时,OPA1裂解部分被抑制,S-OPA1表达量降低,说明Omi/Htr A2通过裂解OPA1,使细胞色素C及Omi/Htr A2等从线粒体释放到胞浆,加重凋亡。免疫共沉淀证明Omi/Htr A2与OPA1之间存在着直接相互作用,这可能是Omi/Htr A2裂解OPA1的基础。而Omi/Htr A2是如何裂解OPA1,其具体机制还有待进一步探究。结论:1.体内外实验证明Omi/Htr A2参与了脑缺血再灌注所致脑神经细胞损伤。2.体外实验进一步证明Omi/Htr A2通过调控线粒体应激,降低线粒体膜电势,裂解OPA1使线粒体的融合受限参与神经细胞的凋亡。