羊肚菌发酵液及其胞外多糖的分析与研究

【摘要】：羊肚菌作为名贵的食用真菌,具有多种有益于身心健康的保健功能,被广大消费者所青睐。近些年来,羊肚菌的液态培养技术逐渐成为科学研究的热点,其液态培养产物更是具有不可限量的应用价值。本文主要对羊肚菌胞外粗多糖产量与羊肚菌菌丝体生物量及羊肚菌胞内粗多糖得率进行研究,同时也分析了羊肚菌发酵液的主要成分和羊肚菌原培养基的关系;对羊肚菌发酵液的急性毒理和遗传毒理的检验进行了评价,并对发酵液中的重要成分(羊肚菌胞外多糖)进行了抗疲劳方面的检验;优化了羊肚菌胞外粗多糖的提取工艺,并对两种不同碳源培养得到的羊肚菌胞外多糖进行了分离纯化;分析比较了两种羊肚菌胞外多糖的结构,通过Chem Bio Office软件推测了羊肚菌胞外多糖的空间结构。主要的研究内容如下:1.以羊肚菌胞外粗多糖产量和羊肚菌菌丝体生物量为考察指标,并考虑生产成本的约束条件,对2种常选的液态培养基进行筛选,确定的优质培养基配方是:马铃薯100g,蔗糖30g,蛋白胨1g,酵母膏5g,Mg SO4 5.0 g,KH2PO45.0 g,水1000m L,保持自然p H值。此培养条件下,羊肚菌菌丝体生物量可达到11.803g/L,羊肚菌胞外多糖的产量可达到1.465g/L。在保证羊肚菌菌丝体生物量和羊肚菌胞内粗多糖得率的情况下,确定液态培养的终止时间为培养后第7天,并计算出羊肚菌胞外粗多糖的产量与羊肚菌菌丝体生物量的比例约为3:20,与羊肚菌胞内粗多糖产量的比例约为10:3。通过对羊肚菌发酵液成分进行分析,确定了羊肚菌胞外粗多糖为其主要成分。2.对处理后的羊肚菌发酵液进行了急性毒理试验和遗传毒理试验,并利用SPSS 20.0数据分析软件对各组试验结果进行了t检验,分析结果均为阴性,初步证明羊肚菌发酵液无毒性。最后通过建立小鼠体力疲劳模型,证明了羊肚菌胞外粗多糖具有缓解体力疲劳的功能,并进一步证明羊肚菌发酵液具有缓解体力疲劳功效,而原培养基并没有这个功效。3.优化羊肚菌胞外粗多糖的提取工艺,在对浓缩温度、乙醇最终浓度、沉淀温度和沉淀时间4个因素进行单因素试验后,利用Design-Expert 8.0.4软件,以羊肚菌胞外粗多糖提取量为试验指标(保证羊肚菌菌丝体生物量和羊肚菌胞内粗多糖得率为前提),构建了二次多项回归模型,并分析了各个变量之间的交互作用效应对羊肚菌胞外粗多糖提取量的影响。最后确定羊肚菌胞外粗多糖的提取工艺条件为:浓缩温度70℃,乙醇最终浓度77%,沉淀温度4℃,沉淀时间19h,此时,羊肚菌胞外粗多糖提取量可达到2.027g/L。然后对两种不同碳源培养得到的羊肚菌胞外粗多糖(碳源分别为马铃薯浸出液和葡萄糖)进行了分离纯化,最后通过高效液相色谱制备出羊肚菌胞外多糖EXPnⅠ(相对分子量2.036?106Da)和羊肚菌胞外多糖EXPnⅡ(相对分子量2.238?106Da)。4.羊肚菌胞外多糖EXPnⅠ和EXPnⅡ均为淡黄色固体粉末,二者均质轻,无臭无味,溶于水,易溶于热水,不溶于无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙醚、氯仿等有机溶剂;均不含有核酸、蛋白质、色素以及糖醛酸;均属于非淀粉类多糖。利用红外光谱确定羊肚菌胞外多糖EXPnⅠ和EXPnⅡ的主要环化方式都是吡喃型糖环,糖链中的主键均为α糖苷键和β糖苷键,且含有乙酰基。与羊肚菌胞内多糖的区别为不含有酰胺基。经过核磁共振的1H-NMR和HSQC图谱分析,推测羊肚菌胞外多糖EXPnⅠ的结构主要是以α-1→4葡萄糖为主链的,以α-1→6、β-1→6、α1-→3或β-1→3连接的半乳糖或者甘露糖为支链的多糖结构。而推测羊肚菌胞外多糖EXPnⅡ的结构是以α1-→6葡萄糖连接为主链的,以α1-→4或β1-→4连接的半乳糖或者甘露糖为支链的多糖结构。由于培养基中提供的碳源不同,最终导致了羊肚菌胞外多糖的结构在连接上有较大的差别。最后,引入Chem Bio Office软件与化学检验相结合来分析和检测羊肚菌胞外多糖的高级结构,为羊肚菌胞外多糖结构的后续研究提供了理论基础。