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河蚌抗氧化肽的制备及其特性研究

徐兆刚  
【摘要】:本文是吉林省现代农业重点科技攻关项目—河蚌制品加工关键技术研究及产品综合开发(20150204034NY)和长春市现代农业发展科技支撑计划项目—河蚌制品加工关键技术研究及资源综合开发利用(13NK13)研究内容的一部分。我国野生河蚌资源丰富,价格低廉,但因其肉质粗韧,加工利用程度较低。生物活性肽具有诸多对人体有益的功能特性及良好的消化吸收性,近年来逐渐受到人们的青睐,目前已成为国内外研究热点之一。因此,从野生河蚌肉中提取抗氧化活性肽具有广阔的发展前景。本文以野生河蚌肉为原料,利用超声波辅助酶解法制备抗氧化肽,采用超滤法与凝胶层析法相结合进行纯化,并对河蚌抗氧化肽的氨基酸组成、抗氧化活性、理化性质及稳定性进行了较为系统的研究,最后通过脂质体技术对河蚌抗氧化肽实现包埋,以期为抗氧化肽的高效提取和野生河蚌资源的综合利用提供理论依据和技术参考。本文主要研究内容和结论如下:1.分析了6种供试蛋白酶对酶解产物还原力和水解度的影响,筛选并研究了中性蛋白酶酶解制备河蚌抗氧化肽的工艺条件,通过单因素试验及Box-Behnken试验设计得到最佳酶解工艺参数为:加酶量4141U/g、酶解温度51℃、p H6.0、酶解时间3.5h;各因素对酶解产物还原力的影响大小顺序为:酶解时间加酶量酶解p H酶解温度。2.在普通酶解工艺优化试验的基础上,采用超声波辅助酶解制备河蚌抗氧化肽,通过单因素及正交试验得出最佳工艺为先加酶后超声处理(加酶量4141U/g,p H6.0);超声功率150w、超声温度40℃、超声时间30min;超声处理后于51℃,继续酶解180min。与普通酶解法相比,采用超声波辅助酶解所得酶解产物(UAH)的综合抗氧化能力较高。3.对河蚌抗氧化肽进行超滤纯化,结果表明:经超滤分离得到的4个分子量范围的组分中UAH-Ⅳ(相对分子量3ku的组分)具有较强的抗氧化能力。采用Sephadex G-25对UAH-Ⅳ进行层析分离并对层析条件进行了研究,结果表明:较适的层析条件为上样浓度25mg/m L(上样体积1m L)、洗脱流速0.7m L/min、洗脱液为去离子水,在此条件下所得的4个分离部分(F1、F2、F3、F4)中,F2具有较强的抗氧化能力。4.对河蚌肉、UAH-Ⅳ及F2的氨基酸组成进行分析研究,结果表明:纯化后河蚌抗氧化肽的疏水性氨基酸等含量均得以提高,且营养价值高,可用其开发具有抗氧化活性的功能性健康食品或功能性高级调味料。5.对超滤组分UAH-Ⅳ及层析组分F2的抗氧化活性进行分析研究,结果表明:两者均具有较强的抗氧化活性。经过Sephadex G-25凝胶层析处理,河蚌抗氧化肽的还原力、自由基清除能力及亚油酸自氧化反应抑制能力均得以提高,尤其是羟自由基清除能力提高了近2倍;UAH-Ⅳ及F2都表现出了较强的螯合Fe2+能力,且具有极强的抑制亚油酸氧化的能力(其抑制效果优于同浓度的Vc和GSH)。6.对河蚌抗氧化肽的理化性质及稳定性的研究,结果表明:p H对UAH的溶解度影响较大,对UAH-Ⅳ的影响较小;UAH的乳化性质及起泡性质要优于UAH-Ⅳ;在4~50℃的温度内两者的抗氧化活性变化较小,而其耐受高温能力较差,但仍可耐受低温巴氏杀菌处理;酸碱条件对样品的还原力影响较低,而对样品的DPPH自由基清除能力影响较大;Zn2+的添加可使UAH和UAH-Ⅳ的活性显著下降,而K+的影响相对较弱;添加6种食品添加剂(氯化钠、葡萄糖、庶糖、可溶性淀粉、柠檬酸和苯甲酸),样品的还原力明显下降,而样品的DPPH自由基清除率影响相对较小;UAH与UAH-Ⅳ,均具有较强的耐胃肠消化的能力。7.通过单因素试验及二次通用旋转组合设计研究了河蚌抗氧化肽常规脂质体的制备工艺,得出最佳制备工艺参数为:超声时间21min、磷脂与胆固醇比例为3.3:1、磷脂与抗氧化肽比例为7.1:1。8.采用聚乙二醇修饰制备河蚌抗氧化肽长循环脂质体,并以蔗糖/甘露醇为冻干保护剂制备冻干脂质体;制备长循环脂质体及冻干脂质体后整体抗氧化活性保留率大于90%,且可以对河蚌抗氧化肽起到缓释的作用。冻干脂质体贮藏稳定性强,贮藏30天后,组织状态基本无变化。创新点:1、利用超声波辅助中性蛋白酶酶解河蚌肉制备抗氧化肽,研究其抗氧化活性、理化特性、稳定性及氨基酸组成,为河蚌高值化利用提供理论依据;2、通过旋转薄膜蒸发法及冷冻干燥法制备河蚌抗氧化肽脂质体,为抗氧化肽产品的生产提供参考。


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