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玉米冷响应相关基因的克隆、功能鉴定及定量蛋白质组学研究

王晓宇  
【摘要】:非生物胁迫,如低温、干旱和盐胁迫等严重限制了植物的生长与产量。其中低温影响植物的生长、发育、空间分布和作物产量。许多重要的粮食作物,如玉米、水稻、大豆、番茄等,对冷比较敏感,冷适应性差。中国东北地区是玉米的主要产区,由于地理条件等因素,春季经常遭受冷害的侵袭,导致玉米大面积减产。随着玉米需求量的不断扩大,如何提高玉米的综合产量成为当务之急。传统育种和分子标记辅助的有效结合能够选育出抗逆和广泛适应性的玉米新品种。为了挖掘参与低温响应的潜在基因和揭示逆境响应机制,本研究以玉米抗冷自交系W9816为实验材料,选取三叶期的叶片和根部组织,采用c DNA-AFLP(c DNA amplified fragments length polymorphism)的方法,利用174对引物组合,比较低温处理前后基因的差异表达情况。根据c DNA-AFLP分析,叶片中发现6829条TDFs(Transcript-derived fragments),根部6955条TDFs。每对引物组合30-50个AFLP扩增带,其大小介于70-600 bp之间。尽管大多数条带在冷胁迫后没有发生明显变化,但在叶片中仍然检测到620个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),根部531个DEGs。这些差异表达基因显示出不同的表达模式。其中,仅61个上调的DEGs和32个下调的DEGs在两种组织中同时具有一致的表达趋势。大多数DEGs冷胁迫后在两种组织中体现出不同的表达趋势。通过NCBI BLASTX和Maize GDB数据库分析,根据其功能将差异表达基因分为5类:信号转导(10,15%)、转录调控(9,13%)、翻译和翻译后修饰(10,15%)、细胞代谢与组织(24,36%),6个DEGs推测为编码蛋白(9%),8个DEGs在数据库中没有匹配(12%)。利用q RT-PCR的方法验证了16个玉米抗冷相关的候选基因。Sec14-like蛋白参与必要的生物学过程,例如磷脂代谢、信号转导、膜运输以及逆境响应。本研究采用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)PCR的方法首次成功克隆了一个磷脂酰肌醇转运相关蛋白Zm SEC14p(accession no.KT932998)。Zm SEC14p基因全长包括一个完整的开放阅读框,推测编码295个氨基酸。染色体定位表明Zm SEC14p基因定位于玉米基因组1号染色体上,横跨3420 bp,包括5个外显子。多重序列比对表明玉米Zm SEC14p与高粱Sb SEC14p氨基酸同源性最高;进化树分析表明Zm SEC14p属于UCSH的一个成员,仅仅包含一个SEC14 domain。I-TASSER结构预测表明Zm SEC14p蛋白包括10个α螺旋、5个β折叠、3个310螺旋,其中,7个α螺旋、5个β折叠以及2个310螺旋可形成磷脂结合口袋。基因表达模式研究发现,Zm SEC14p基因转录受低温、盐以及ABA诱导表达;组织特异性分析表明Zm SEC14p在玉米叶片中表达最高。亚细胞定位表明Zm SEC14p蛋白主要定位于细胞核。对过表达Zm SEC14p转基因拟南芥植株在不同生长发育时期抗逆表型鉴定发现:在种子萌发阶段,转基因植株能够显著降低对低温的敏感性,提高了对Na Cl和ABA的敏感性;在苗期,转基因植株在低温胁迫下具有更快的初生根生长速率;对生殖生长发育时期Zm SEC14p转基因株系的抗冷表型鉴定结果表明,转基因株系较野生型株系存活率提高了约38%。活性氧组织定位以及抗氧化酶(SOD、POD)活性测定实验表明,低温胁迫后,相比于野生型株系,转基因株系能够显著提高POD和SOD抗氧化酶的活性,酶活的提高与Zm SEC14p调控抗氧化相关基因的表达有关。脯氨酸含量测定实验表明,低温处理48 h后,Zm SEC14p转基因株系的脯氨酸含量分别是野生型的1.35和1.61倍。低温胁迫下,转基因拟南芥中一些逆境胁迫应答基因(如CBF3、COR6.6、RD29B)的表达量较野生型显著上调。上调表达的逆境响应基因推测与Zm SEC14p调节磷脂酶C(PLC)基因的表达与酶的活性相关。利用i TRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白质组学方法比较低温处理前后玉米叶片蛋白质丰度变化情况。实验结果表明低温胁迫共鉴定到173个差异丰度蛋白(Differential abundance protein species,DAPS)。这些DAPS被分为以下功能类别:碳和能量代谢(38,22.0%)、转录后调节(13,7.51%)、翻译、核糖体的结构与合成(15,8.67%)、翻译后修饰、蛋白折叠与分子伴侣(14,8.09%)、氨基酸转运和代谢(13,7.51%)、逆境响应(12,6.94%)、信号转导(9,5.20%)、脂类代谢(5,2.90%)、次生代谢的生物合成(6,3.47%)、无机离子的转运和代谢(2,1.16%)、复制、重组和修复(2,1.16%)、其它生物学过程(22,12.71%)和未知生物学过程(22,12.71%)。生物信息分析表明159个DAPS被注释到38个GO(Gene Ontology)功能组;108个DAPS被分为20个COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)类别;99个DAPS参与60个KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路。抗氧化实验证明了i TRAQ实验结果的可靠性。转录谱与蛋白谱的关联分析表明低温胁迫玉米叶片中存在转录后调节和翻译后修饰等过程。基于蛋白的功能性分析,玉米苗期低温胁迫响应的适应性机制可能包括缓解由于叶绿体膜能量过剩引起的光损伤;通过糖酵解产生更多的能量;增加逆境响应蛋白的丰度;提高清除ROS的整体能力。转录后调节和翻译后修饰在玉米低温胁迫响应中也扮演重要的角色。目前还未见到有关玉米苗期低温胁迫蛋白质丰度变化的研究报道。综合以上研究表明,Zm SEC14p作为逆境胁迫响应基因在逆境调控网络中起正向调控作用,同时,本研究从转录水平、蛋白质水平进行研究,增加了对玉米冷响应机制的理解,为今后通过基因工程改良玉米抗逆性提供了重要的候选基因。


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