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Hsa-miR-888-5p在肝细胞癌中的表达及对增殖、侵袭和转移的影响及机制的初步研究

郝恩源  
【摘要】:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,肝细胞癌发病率和病死率均较高。多年来的研究证实虽然影像学检测水平的不断提高增加了肝细胞癌的发现率,但是对肝细胞癌仍缺乏有效的早期诊断及预后判断指标。尽管手术和肝移植是首选的治疗策略,但其适应症范围有限,且根据不同的肿瘤分级标准其术后5年复发率仍大于70%。肝细胞癌对化疗、放疗、免疫治疗效果不佳,目前临床上应用的化疗药物与靶向治疗药物虽能有效杀伤肝癌细胞,但均存在副作用较大与长期应用后肿瘤耐药的问题。因此,目前在临床和科研中应更深层次的探索肝癌的发病机制,做到早诊断、早治疗并能够及时控制肿瘤进展。因此目前亟待解决的医学难题之一就是寻找HCC的早期诊断指标和药物治疗的新靶点。MicroRNA(miRNA)广泛存在于真核细胞生物及病毒中,近年来其作为调控基因所发挥的重要生物学作用被逐步确认。MiRNA研究不断取得的重大进展也为了解和研究疾病的分子发病机制和设计新的治疗策略提供了全新的视角,目前miRNA己经成为分子生物学和医学研究的重要热点领域。Hsa-miR-888-5p最近已在乳腺癌和前列腺癌的研究中有所报导,但是hsa-miR-888-5p在肝细胞癌中的具体生物学行为经文献检索并没有相关的研究报道。本论文研究的主要目的是阐明hsa-miR-888-5p在HCC中的作用并初步探讨其生物学作用机制。本论文首先检测了hsa-miR-888-5p在HCC细胞株、组织中表达水平。其次,利用miRNA拟似物转染SMMC-7721细胞株,进行体外实验,检测hsa-miR-888-5p在HCC的发生和进展等生物学行为中的作用;继而阐明hsa-miR-888-5p在HCC的增殖、分化、侵袭和迁移中的作用机制。并进一步检测MMP 9,MMP 2及p53在高表达hsa-miR-888-5p的细胞中的表达改变,从基因水平探讨hsa-miR-888-5p在HCC中可能的作用机制。一、肝癌细胞中hsa-miR-888-5p的表达研究:利用qRT-PCR的方法检测hsa-miR-888-5p在正常肝细胞株HHL-05、L02及肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、BEL7402、Hu-7中的表达;并检测了HCC患者癌组织及癌旁健康组织中hsa-miR-888-5p的表达差异。实验结果证实肝癌细胞株相对正常肝细胞株的hsa-miR-888-5p表达均明显上调。Hsa-miR-888-5p在肝细胞癌手术切除相关标本中的表达与肿瘤的组织学分化程度和肿瘤分期及术后三年的生存率有关(P0.05)。分析实验数据我们得出以下结论:hsa-miR-888-5p在HCC细胞株、临床切除肝癌组织中均表达上调。二、Hsa-miR-888-5p对肝癌细胞株生物学性状的影响:利用hsa-miR-888-5p mimics转染SMMC-7721细胞之后,获得过表达hsa-miR-888-5p的肝癌细胞株。应用MTT检测hsa-miR-888-5p对SMMC-7721细胞增殖的影响;应用平板克隆形成方法检测hsa-miR-888-5p对SMMC-7721细胞克隆形成能力的影响;应用transwell方法检测hsa-miR-888-5p对SMMC-7721细胞迁移及侵袭的影响。MTT实验及克隆形成实验均证实hsa-miR-888-5p有促进SMMC-7721增殖的趋势,经分析有统计学差异。Transwell迁移/侵袭实验结果证实hsa-miR-888-5p可以在体外提高SMMC-7721细胞株的迁移及侵袭能力。依据第二部分实验结果得出以下结论:hsa-miR-888-5p具有在体外提高SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭的生物学特性。三、高表达hsa-miR-888-5p对MMP 9、MMP 2和p53基因表达的影响:基于上述实验,设计或购买MMP 9,MMP 2及p53的相关引物,应用q RT-PCR检测hsa-miR-888-5p对于SMMC-7721肝癌细胞株MMP 9,MMP 2及p53基因表达的影响。应用明胶酶谱法检测MMP9,MMP 2在SMMC-7721肝癌细胞外液中的表达变化。然后分别提取蛋白,进行Western blot反应检验MMP 9,MMP 2及p53蛋白产物改变。经q RT-PCR检验结果显示SMMC-7721细胞转染hsa-miR-888-5p后,MMP 9,MMP-2的基因表达明显升高,而p53表达则明显降低。而作为内参对照的β-actin或GAPDH的数值在两组当中都非常稳定。明胶酶谱法检测MMP 9,MMP 2在细胞外液中的表达结果显示:在mimics组MMP 9,MMP 2的表达较对照组明显升高且差别显著。通过分析Western blot的实验结果证实hsa-miR-888-5p的表达水平对于MMP 9,MMP 2及p53的蛋白表达水平具有调控作用。高表达hsa-miR-888-5p组与对照组间比较,上述蛋白中MMP 9,MMP 2的表达量显著升高,而p53的蛋白表达水平则正好相反,其差异具有统计学意义(P0.01)。经由上述研究,本文首次初步阐明hsa-miR-888-5p在HCC中表达上调,并与肝癌组织学分化程度和肿瘤分期及术后三年的生存率有关。其表达水平的改变在促进HCC的形成和发展中起着重要的作用;hsa-miR-888-5p可能通过调节MMP 9,MMP 2和p53基因的表达改变了HCC的生物学行为。通过高表达hsa-miR-888-5p在HCC肿瘤细胞中所发挥的作用也进一步揭示了其应用于临床诊疗的可行性。然而hsa-miR-888-5p的临床实用性与应用范围的扩展则有赖后续的进一步研究。


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