Bcl-2通过内质网与线粒体间Ca~(2+)交叉对话调控卵巢癌顺铂凋亡敏感性的作用机制

【摘要】：卵巢癌是临床上常见的、致命的妇科癌症之一,由于早期症状不明显和生长位置隐蔽,绝大多数患者检查出来已经属于卵巢癌晚期。目前,顺铂仍是治疗多种实体瘤的一线化疗药物,包括卵巢癌。但在使用过程中逐步产生的耐受性限制了顺铂在临床上的应用。最新的研究显示只有少量的顺铂进入到细胞核,抑制DNA的复制。大部分的顺铂主要聚集在线粒体、溶酶体、内质网(endoplasmic reticulum,ER)等细胞器和胞浆中,并在这些细胞器内启动或放大凋亡信号。随着研究的深入,人们开始关注溶酶体-细胞核、线粒体-细胞核、ER-线粒体等不同细胞器在结构和功能上的偶联在细胞凋亡中的作用。ER是细胞内的主要Ca~(2+)库,参与细胞内Ca~(2+)稳态和信号转导。Ca~(2+)转运至ER主要是通过肌质网型钙离子ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase,SERCA)实现的,而ER Ca~(2+)释放通道主要是肌醇1,4,5-三磷酸受体(inositol1,4,5-trisphosphate(IP3)receptor,IP3R)和兰尼定受体(ryanodine receptor,Ry R)。ER Ca~(2+)稳态不仅可以维持着ER的正常生理功能,也参与了胞浆和线粒体的Ca~(2+)稳态。胞浆和线粒体的Ca~(2+)稳态在维持线粒体功能、代谢、增殖和存活中发挥重要的作用。最新的研究显示Ca~(2+)与肿瘤的药物耐受性息息相关。而抗凋亡蛋白Bcl-2可以通过抑制ER Ca~(2+)释放和线粒体Ca~(2+)超载介导药物耐受性。通过胞浆和线粒体Ca~(2+)荧光探针,研究人员证实了在顺铂敏感肿瘤细胞(Bcl-2低表达)内,顺铂能引起胞浆和线粒体Ca~(2+)上调,进而诱导ER途径的凋亡和线粒体途径的凋亡,而这种现象在顺铂耐受肿瘤细胞(Bcl-2高表达)内并没有发生。这提示了胞浆和线粒体Ca~(2+)与顺铂耐药密切相关。ER-线粒体的偶联能够促使Ca~(2+)高效地从ER转移至线粒体。Ca~(2+)是线粒体与ER信息交流的主要分子。线粒体相关ER膜(mitochondria associated ER membranes,MAM)是线粒体与ER信息交流的结构基础。MAM不仅提供了两个细胞器之间的结构性关联,还参与了脂质转运、线粒体分裂和融合、炎症小体及自噬小体的形成等。此外,MAM的组成成分及结构是动态的,随着细胞处于不同的应激状态,如ER应激而改变。目前,已有研究表明在MAM上表达的蛋白有上千种,其参与了神经退行性疾病、肥胖、肿瘤及心血管疾病等病理过程。线粒体融合蛋白2(mitofusion2,Mfn2)是线粒体和ER间的连接桥梁。也有研究表明si Mfn2能通过减弱ER-线粒体之间的关联增加癌细胞对药物的耐受性。有趣的是,抗凋亡蛋白Bcl-2也在MAM上表达,通过调控线粒体融合分裂和ER膜重构影响ER和线粒体间的偶联。但我们尚不清楚癌细胞耐药是否与Bcl-2在MAM上的表达有关,亦或与ER-线粒体间的Ca~(2+)交叉对话有关。胞浆的Ca~(2+)上调能激活钙蛋白酶-1(calpain-1),它是一种Ca~(2+)依赖半胱氨酸蛋白酶,calpain-1的激活可以通过促进Bax寡聚化和caspase-4的活化诱导线粒体途径的凋亡和ER途径的凋亡。线粒体的Ca~(2+)超载会导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,PTP)的开放,诱导细胞色素C(Cytochrome C,Cyto C)释放至胞浆,触发了线粒体途径的凋亡。因此,我们推测胞浆Ca~(2+)或ER-线粒体间的Ca~(2+)信号转导可能参与到了癌细胞耐药过程中。在本研究中,我们选择人卵巢癌顺铂耐药细胞株为研究对象,利用Bcl-2抑制剂ABT737和si Bcl-2,从影响ER-线粒体交互作用的角度,以Ca~(2+)为切入点,探讨抗凋亡蛋白Bcl-2在卵巢癌耐药中的作用机制,为临床治疗顺铂耐受性卵巢癌提供新的策略。方法:(1)观察ABT737对人卵巢癌顺铂耐药细胞株顺铂凋亡敏感性的影响。MTT法检测ABT737联合顺铂对人卵巢癌SKOV3/DDP、A2780/DDP和COC1/DDP细胞存活率的影响;Hoechst33342染色检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。(2)观察ABT737对SKOV3/DDP荷瘤鼠顺铂化疗敏感性的影响效果。建立人卵巢癌SKOV3/DDP荷瘤鼠模型,观察ABT737联合顺铂对移植瘤生长的影响;称量移植瘤的重量;TUNEL染色检测细胞凋亡;免疫组化检测cleaved caspase-3的表达。(3)检测ABT737联合顺铂对SKOV3/DDP细胞ER和线粒体关联的影响。间接免疫荧光法检测IP3R和VDAC1的共定位情况;Percoll离心法分离亚细胞结构,wes t e rn bl ot检测这些细胞器的标记蛋白。此外,western blot法检测了Grp75、Mfn2和VDAC1在MAM中的表达;免疫共沉淀检测IP3R和VDAC1在MAM中的共定位情况;透射电镜检测线粒体和ER的关联程度。(4)检测ABT737联合顺铂对SKOV3/DDP细胞胞浆和线粒体Ca~(2+)水平的影响。用胞浆Ca~(2+)荧光探针Fluor-4/AM和线粒体Ca~(2+)荧光探针Rhod-2/AM孵育细胞,应用激光共聚焦显微镜观察胞浆和线粒体Ca~(2+)浓度的变化。(5)观察ABT737联合顺铂对SKOV3/DDP细胞ER途径凋亡的影响。间接免疫荧光法检测ER应激标志性蛋白PDI的表达;Western blot法检测calpain-1、PDI、Grp78和CHOP的表达,同时也检测caspase-4的活化。(6)观察ABT737联合顺铂对SKOV3/DDP细胞线粒体途径凋亡的影响。流式细胞仪检测线粒体膜电位;western blot法检测胞浆Cyto C、Bcl-2和Bax的表达,同时也检测caspase-9和caspase-3的活化。(7)检测si Bcl-2联合顺铂对SKOV3/DDP细胞存活率、凋亡、细胞内Ca~(2+)水平以及ER和线粒体关联的影响。Western blot法检测Bcl-2的表达水平;MTT检测细胞的存活率;流式细胞术检测细胞的凋亡率;激光共聚焦显微镜检测胞浆和线粒体Ca~(2+)浓度的变化;透射电镜检测线粒体和ER的关联程度。结果:(1)顺铂降低SKOV3/DDP、A2780/DDP和COC1/DDP细胞的存活率并诱导了它们的凋亡。而ABT737联合顺铂能进一步降低细胞的存活率和诱导它们的凋亡。(2)ABT737联合顺铂能更加抑制SKOV3/DDP裸鼠移植瘤的生长;与顺铂组相比,移植瘤重量在联合用药组降低;ABT737增加了顺铂诱导的DNA断裂以及caspase-3的活化。(3)ABT737增加了顺铂诱导的ER标志蛋白IP3R和线粒体标志蛋白VDAC1的共定位;我们提取的MAM蛋白具有很高的纯度;Western blot结果表明在VDAC1量一定的前提下,ABT737增加了顺铂诱导的MAM上的Grp75和Mfn2的表达;免疫共沉淀结果表明在MAM上,ABT737增加了顺铂诱导的IP3R和VDAC1的关联;通过透射电镜,我们发现ABT737增加了顺铂诱导SKOV3/DDP细胞的ER和线粒体的关联。(4)与顺铂组相比,ABT737联合顺铂增加了SKOV3/DDP细胞胞浆和线粒体的Ca~(2+)水平。通过ER Ca~(2+)释放通道IP3R的抑制剂2-APB,我们证明了ABT737增加了顺铂诱导的Ca~(2+)从SKOV3/DDP细胞ER释放至胞浆和线粒体。(5)ABT737也增加了顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞calpain-1、PDI、Grp78和CHOP的表达以及caspase-4的活化。这表明了ABT737增加了顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞ER途径的凋亡。(6)与顺铂组相比,ABT737联合顺铂能降低SKOV3/DDP细胞线粒体膜电位,同时增加了Bax/Bcl-2的比值、胞浆Cyto C的表达、caspase-9和caspase-3的活化。这说明了ABT737增加了顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞线粒体途径凋亡。(7)降低Bcl-2的表达后,顺铂更能降低SKOV3/DDP细胞的存活率和促进其凋亡,也进一步升高了胞浆和线粒体的Ca~(2+)水平,同时也增加ER和线粒体的关联。结论:我们在体外和体内水平均证明了ABT737可以增加人卵巢癌细胞顺铂凋亡敏感性。同时,我们也在体外水平证明了si Bcl-2和顺铂在诱导SKOV3/DDP细胞凋亡中具有良好的协同作用。基于我们的实验结果,我们推测抗凋亡蛋白Bcl-2可能通过抑制ER Ca~(2+)释放以及线粒体和ER之间的关联促进了人卵巢癌顺铂耐受性。ABT737或si Bcl-2通过增加SKOV3/DDP细胞ER Ca~(2+)释放,并增强线粒体和ER间的Ca~(2+)串话增加了顺铂诱导的ER途径的凋亡和线粒体途径的凋亡。因此,抗凋亡蛋白Bcl-2是扭转卵巢癌患者顺铂耐受性的重要潜在靶点。本研究以MAM为切入点,为通过靶向细胞器相互作用而实现个体化治疗提供了新的线索。