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BRCA1蛋白表达在骨肉瘤细胞MG-63放化疗疗效评估中的作用及其机制研究

张乐宁  
【摘要】:背景:骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,其起源于骨间叶细胞,好发于儿童及青少年,第二个发病高峰出现在60-80岁之间。发病有性别差异,男性多于女性。发病位置多见于长骨,例如肱骨和胫骨近端、股骨远端。大约20%患者确诊时已经为晚期转移患者,肺转移居多,远处转移是骨肉瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。目前治疗以新辅助化疗结合手术为主,虽然局部病变患者5年生存期从1970年的20%上升至如今的60%以上,但是对于晚期转移的骨肉瘤患者来说仍是一个不小的挑战,5年生存期降至30%以下,近30年针对骨肉瘤的治疗手段未有实质性进展,急需更加有效的治疗方案。综上,考虑骨肉瘤患者发病年龄轻、恶性程度极高、治疗方法单一和毒副作用大,并且总体效果不佳的情况下,寻找更加新颖、安全有效、低毒副作用的新兴治疗方案已成为国内外学者瞩目的研究之一。目前与骨肉瘤发生发展相关的关键基因包括TP53、Rb1、FAS、ATRX、PTEN、COX-2、HER2等。尽管已经有这些研究进展,但是仍缺乏一个能准确预测骨肉瘤进展、转移和对化疗反应性的标志性分子。BRCA1是乳腺癌易感基因,位于染色体17q21,并且编码1863个氨基酸蛋白,BRCA1有24个外显子,最大的是第11外显子,在第11外显子中富含乳腺癌患者最重要也是最常见的突变基因。BRCA1是抑癌基因,能通过多条细胞转导通路抑制细胞增殖、细胞生长,阻滞细胞于G2/M期,并诱导细胞凋亡。BRCA1的发挥抑癌作用可能与多条信号通路有关,如BRCA1-MAPK通路、BRCA1-p53通路、BRCA1-Gdd45通路有关,其中BRCA1-p53通路涉及细胞凋亡,BRCA1可以调节p53基因表达,而且p53直接调控凋亡蛋白Bcl-2及其家族蛋白Bax的表达,因此BRCA1可以通过调节p53的表达从而影响凋亡蛋白Bcl-2及其家族Bax的表达。BRCA1还涉及DAN损伤、修复过程,并且与同源重组修复(HRR)密切相关,因此BRCA1作为抑癌基因参与了乳腺癌、肺癌等许多恶性肿瘤的发生发展过程。但是,到目前为止国内外对于BRCA1与骨肉瘤的相关性研究却较为缺乏,因此本研究将重点关注BRCA1与骨肉瘤的相关性研究方面,尤其侧重在BRCA1与骨肉瘤细胞MG-63放化疗的疗效评估方面进行研究。目的:研究BRCA1在人骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中的表达情况及其临床意义。观察骨肉瘤细胞MG-63在放化疗的作用下,BRCA1表达水平对肿瘤细胞增殖、侵袭、细胞周期和凋亡的影响,从而探讨BRCA1蛋白表达在骨肉瘤细胞MG-63放化疗疗效评估中的潜在价值。方法:利用免疫组化的方法检测BRCA1在45例人骨肉瘤组织、22例软骨肉瘤以及骨肉瘤细胞MG-63中的表达,探讨BRCA1的表达情况与临床病理因素的联系,以及在骨肉瘤细胞MG-63中的表达水平。利用RT-PCR、Western Blot方法检测骨肉瘤细胞MG-63在放疗(分别为0Gy、0.5Gy、1.0Gy、1.5Gy、2.0Gy)、化疗(分别为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)及放化疗联合(分别为0Gy+0μg/ml、2Gy、5μg/ml、2Gy+5μg/ml)作用下的BRCA1、p53、Bax和Bcl-2的表达水平。利用CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验、Annexin V-Fitc和PI双染细胞凋亡实验对骨肉瘤细胞MG-63在放、化疗及放化疗联合作用下肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力和肿瘤细胞凋亡等情况进行检测。结果:1.临床病理证实BRCA1在人骨肉瘤组织高表达(29/45),软骨肉瘤(3/22),在骨肉瘤癌旁组织中无BRCA1表达,在骨肉瘤细胞MG-63表达。骨肉瘤组织的BRCA1阳性表达率显著高于软骨肉瘤组织,二者相比差异有统计学意义(P0.05)。BRCA1表达情况与骨肉瘤临床病理因素中的肿瘤坏死存在显著关联,二者相比差异有统计学意义(P0.05),BRCA1表达情况与年龄、性别、WHO分型、病变位置、遗传因素、肺转移、Codman三角、病理性骨折和病理边界相比无统计学意义(P0.05)。2.在骨肉瘤细胞MG-63中,放疗可以抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖,且随剂量的增加,抑制作用越明显;促进骨肉瘤细胞MG-63凋亡;引起骨肉瘤细胞G2期阻滞,且随着剂量的增加阻滞加剧;抑制骨肉瘤细胞MG-63的侵袭,且随剂量的增加,细胞数减少越明显;抑制骨肉瘤细胞MG-63中BRCA1、p53基因和蛋白的表达;抑制Bax蛋白的表达,促进Bcl-2蛋白的表达。3.在骨肉瘤细胞MG-63中,顺铂可以抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖,且随剂量的增加,抑制作用增强;促进骨肉瘤细胞MG-63凋亡,且随剂量的增加,凋亡细胞数也增加;引起MG-63细胞G2期阻滞,且随着剂量的增加阻滞加剧;抑制骨肉瘤细胞MG-63的侵袭,且随剂量的增加,细胞数减少越明显;抑制BRCA1、p53基因和蛋白的表达;抑制Bax蛋白表达,促进Bcl-2蛋白的表达。4.在骨肉瘤细胞MG-63中,放化疗联合作用抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖更显著;其促进细胞凋亡效果介于放疗和化疗之间;引起骨肉瘤细胞MG-63G2期阻滞的效果介于放疗和化疗之间;抑制骨肉瘤细胞MG-63的侵袭,抑制细胞侵袭的作用优于单纯放疗组和化疗组;放化疗联合作用对骨肉瘤细胞MG-63中BRCA1蛋白表达和p53基因表达的抑制效果优于单纯放疗组和化疗组;对Bax蛋白表达的抑制作用和对Bcl-2蛋白表达的促进作用优于单纯放疗组和化疗组。结论:1、BRCA1在骨肉瘤组织中高表达,在骨肉瘤癌旁组织中不表达,且骨肉瘤组织的BRCA1阳性表达率显著高于软骨肉瘤组织。提示其表达可能与骨肉瘤的发生、发展密切相关,检测BRCA1的表达将对骨肉瘤的早期诊断、判断恶性程度及预后具有指导意义。2、放疗、化疗及放化疗联合均可以抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖、侵袭,引起细胞周期G2期阻滞,并促进细胞凋亡;同时抑制BRCA1和p53的表达,抑制Bax表达而促进Bcl-2的表达。提示BRCA1可能通过BRCA1-p53通路发挥作用。3、放化疗联合对骨肉瘤细胞MG-63的增殖、侵袭的抑制作用、对BRCA1和p53表达的抑制作用、对Bax表达的抑制和Bcl-2表达的促进作用较单纯放疗组和单纯化疗组更加显著。提示放化疗联合治疗是骨肉瘤治疗的较好手段,并认为BRCA1蛋白的表达可以作为人骨肉瘤细胞MG-63放化疗疗效的评价指标之一。


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