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5-HT诱导肝癌细胞自噬及其机制的初步研究

李树林  
【摘要】:自噬是真核生物中高度保守的细胞内降解途径,是一个对大多数细胞至关重要的分解代谢过程,它对通过循环细胞质成分在应激条件下维持细胞稳态和细胞存活起到至关重要的作用。自噬是细胞内最重要的蛋白质降解途径之一,可以促进消除大部分的异常蛋白质、多余或损伤的细胞器乃至整个生物体。巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬是自噬最基本的三种类型。它们发生的机制和功能是不同的。我们目前所说的自噬是巨自噬,它以能够形成称为自噬体的双层膜囊泡为最显著的特征。能够诱导自噬的因素有很多,例如化学药物雷帕霉素、缺氧和营养饥饿等。与酵母细胞中的自噬相比,哺乳动物细胞中的自噬是一个异常复杂的生理过程,涉及抗原递呈、病原清除、细胞应激、生存、衰老和死亡等过程。现代研究表明,自噬与包括自身免疫性疾病、肌营养性疾病、帕金森病、心血管疾病、衰老和癌症等多种疾病的发病机制有关。虽然自噬与这些疾病的关系还没有研究透彻,但是自噬作为治疗多种疾病的靶标已成为当前的研究热点。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是人体中枢神经系统中的一种单胺类神经递质、肠道中的局部介质和血液中的血管活性剂。色氨酸、镁、锌和脂肪酸等营养物质参与5-HT的合成。5-HT能够影响人的情绪、睡眠和食欲等。人体内的5-HT通过与相应的受体特异性结合从而发挥作用,目前已有7种5-HT受体亚型被发现。已有研究表明,5-HT通过5-HT1和5-HT2受体在侵袭性癌症和类癌中表现出生长刺激作用。选择性5-HT转运蛋白抑制剂、5-HT受体拮抗剂和5-HT合成抑制剂已成功用于预防癌细胞生长等方面。另有研究表明,ROS能够诱导癌细胞自噬[1],且ROS在癌症的发生、转移等方面发挥着非常重要的作用。基于自噬、ROS和5-HT均与癌症的密切联系,5-HT能否诱导癌细胞自噬已经成为一个值得研究的问题。本文以Hep G2和Hep3B细胞为模式细胞,对5-HT能否诱导肝癌细胞自噬及可能的机制进行初步研究。首先,我们建立了带有GFP-LC3质粒的Hep G2和Hep3B细胞系,用不同浓度的5-HT处理不同时间后,在荧光显微镜下观察Hep G2和Hep3B细胞的GFP-LC3荧光斑点;利用western blot技术检测Hep G2和Hep3B细胞中自噬标志蛋白LC3和p62的表达情况。结果显示,5-HT均能够诱导Hep G2和Hep3B细胞内GFP-LC3斑点增多,而且我们明确了5-HT对自噬的最佳诱导浓度和最佳诱导时间;5-HT能够显著增强Hep G2和Hep3B细胞中LC3蛋白的表达量和p62蛋白的降解。其次,我们用western blot技术检测了不同浓度的5-HT处理不同时间后Hep G2和Hep3B细胞内自噬相关蛋白m TOR、4E-BP1、p70S6K、AMPKα、AMPKβ、ERK、p38、JNK、ULK1蛋白的磷酸化水平。利用western blot分析了用PD 98059(ERK抑制剂)、SP 600125(JNK抑制剂)和SB 203580(p38抑制剂)预处理,5-HT处理后Hep G2和Hep3B细胞内的ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化水平和LC3蛋白的表达水平。结果表明,5-HT不能抑制Hep G2和Hep3B细胞中m TOR、4E-BP1、p70S6K的磷酸化,但能够诱导ULK1、AMPKα、AMPKβ、JNK、ERK、p38的磷酸化;SP 600125可抑制5-HT诱导的JNK、ERK、p38的磷酸化,SB 203580可抑制5-HT诱导的p38、ERK的磷酸化,PD 98059可抑制5-HT诱导的ERK的磷酸化,因此,5-HT诱导Hep G2和Hep3B细胞自噬发生是依赖于JNK/p38/ERK途径的。最后,我们利用DHR 123探针以及荧光酶标仪检测细胞内ROS的水平,结果显示5-HT能够诱导Hep G2和Hep3B细胞ROS增多,且ROS清除剂NAC显著抑制了5-HT诱导的Hep G2和Hep3B细胞的GFP-LC3荧光斑点及western blot结果的LC3-II蛋白表达水平,表明ROS为5-HT诱导肝癌细胞自噬所必须。本研究结果表明,5-HT能够诱导肝癌细胞发生自噬且是通过激活AMPK/ULK1和JNK/ERK/p38途径的磷酸化而不是通过抑制m TOR途径的磷酸化诱导了肝癌细胞自噬的发生,并且5-HT诱导两种细胞ROS产量显著升高,且ROS参与了5-HT诱导的自噬的发生。


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