多环芳烃—菲基于纳米金和纳米磁性颗粒的免疫学检测技术研究

【摘要】：多环芳烃(PAHs)是一类广泛存在于环境中由两个或两个以上苯环以线性、角状排列或簇聚排列所构成的疏水性有机化合物。PAHs来源于自然活动和人类活动,对生物具有致畸、致癌和致突变性。由于PAHs的广泛存在性及其毒性,对人类的健康造成了极大的威胁。目前对PAHs的检测多为仪器分析法,但仪器法存在前处理过程复杂、检测所需仪器昂贵以及所用试剂环境不友好等问题。鉴于以上原因,亟待发展几种更为有效的检测方法,能够快速、灵敏、特异的对水体中的PAHs进行监测。本文以水体污染中常见的一种PAHs-菲(Phe)为分析物,基于抗原与抗体间的特异性反应建立了五种免疫分析方法,实现对水体中PAHs进行检测的目的。主要内容如下:1.Phe完全抗原的合成采用活泼酯法,以2-菲丁酸为半抗原,BSA和OVA为载体蛋白,通过改变Phe与载体蛋白的摩尔比以及改变反应体系中物质的浓度,制备一组免疫原(M1-6)和包被原(N1-3)。通过紫外可见光分光光度法,鉴定完全抗原偶联成功。Phe-BSA和Phe-OVA的偶联比分别为1.2(M1),25.8(M2),30.2(M3),4.6(M4),11.6(M5),20.2(M6),3.6(N1),16.9(N2)和25.7(N3)。比较不同偶联比的免疫抗原对Balb/C小鼠免疫效果的影响,结果表明,以偶联比在26左右的M2为免疫原所得的小鼠抗血清亲和力最高。2.Phe单克隆抗体的制备及鉴定以M2为免疫原,采用足垫法免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术、阳性杂交瘤筛选及克隆,获得一株能稳定分泌抗Phe抗体的杂交瘤细胞株1G7,该单克隆抗体亚型为Ig G1,纯化后抗体效价为1:6.4×105,亲和力常数为3.29×108 L/mol。3.Phe间接竞争ELISA检测方法的建立利用该单克隆抗体建立了Phe间接竞争ELISA检测方法。所建立的方法对Phe的最低检测限为2.48 ng/m L,检测范围为3.17 ng/m L-100.13 ng/m L。Phe在水样中的添加浓度在10、40和80 ng/m L时,添加回收率在90.6%-106.8%之间。4.Phe鲁米诺化学发光MNPs-ic CLISA检测方法的建立表面修饰有氨基的磁性纳米颗粒(MNPs)与2-菲丁酸偶联制备MNPs-Phe探针,建立鲁米诺化学发光MNPs-ic CLISA方法用于快速、灵敏检测水样中的Phe。该方法对Phe的检测范围为1.85 ng/m L-71.51 ng/m L,最低检测限为0.85 ng/m L。所建立的MNPs-ic CLISA方法与ic-ELISA方法相比,灵敏度提高近三倍,时间缩短90多分钟。PAHs在三种水样中的添加回收率分别在97.2%-103.4%,95.8%-104.8%和96.9%-103.5%之间。所建立的MNPsic CLISA方法与ic-ELISA方法的相关性较高,R2=0.9986。5.Phe荧光免疫分析(FLISA)方法的建立以异硫氰酸罗丹明B(RBITC)为荧光染料标记于菲的单克隆抗体制备RBITC-Mc Ab探针用于检测水样中的Phe。所建立的FLISA方法对Phe的检测范围为2.10 ng/m L-91.95 ng/m L,最低检测限为1.05 ng/m L,比ic-ELISA灵敏度提高近二倍。本方法只需一步竞争反应即可完成分析,检测时间比ic-ELISA缩短70多分钟。在饮用水、污染水和生活用水中PAHs的平均添加回收率为100.7%,100.8%和101.2%。所建立的FLISA方法和ic-ELISA方法检测样品中的PAHs结果相关性为R2=0.9948。6.基于反应激活型荧光探针检测Phe方法的建立基于RBITC与纳米金颗粒(Au NPs)的荧光共振能量转移(FRET)作用构建了反应激活型荧光探针用于检测Phe。对Phe的检测范围为46.22 pg/m L-1787.62 pg/m L,最低检测限为21.36 pg/m L,比ic-ELISA灵敏度提高近100倍,只需45 min即可完成整个检测过程。PAHs在三种水样中的添加量为500,1000和1500 pg/m L时,添加回收率分别为94.4%-106.3%、95.9%-107.6%和95.9%-105.8%。7.基于MNPs和Au NPs双纳米探针检测Phe方法的建立以MNPs-Phe探针为固定相,以HRP-Au NPs-Mc Ab探针作为信号放大分子,建立基于MNPs和Au NPs双纳米探针方法检测Phe。通过对实验条件进行优化,Phe的检测范围为0.14 ng/m L-6.55 ng/m L,最低检测限为0.08 ng/m L,检测时间为26 min。与ic-ELISA方法相比,灵敏度提高了30倍,检测时间缩短了5倍。实际水样品添加回收实验表明,饮用水的回收率范围为90.5%-109.8%,污染水的回收率范围为91.2%-108.0%,生活用水的回收率范围为93.0%-107.8%。