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炎症因子诱导胰岛β细胞凋亡模型中CK2/NF-κB信号通路的作用研究

吕游  
【摘要】:背景:炎症介导的胰岛β细胞凋亡是糖尿病发生发展的重要途径之一。转录因子NF-κB在此过程中起到了关键作用,其信号通路被多种炎症因子、代谢应激等激活后,导致NF-κB从细胞浆向细胞核内移位,从而诱导胰岛β细胞凋亡。近年来,越来越多的研究结果发现,CK2与细胞凋亡存在密切的关系。而CK2是否通过NF-κB信号通路参与调控胰岛细胞凋亡的机制尚不明确。目的:本研究应用炎症因子(TNF-α+IFN-γ+IL-1β)联合作用于胰岛β细胞系MIN6,建立胰岛β细胞凋亡模型;观察在炎症环境下胰岛β细胞凋亡情况以及NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化。另外,通过siRNA下调CK2的蛋白表达,比较siRNA干预前后CK2对于胰岛β细胞凋亡、NF-κB信号通路及胰岛β细胞功能的影响。方法:联合应用不同浓度梯度的炎症因子处理胰岛β细胞系MIN6,分别处理24小时、48小时及72小时。CCK法检测胰岛β细胞活性。流式细胞仪及Hoechst/PI染色检测胰岛β细胞凋亡。免疫荧光检测炎症因子处理后的不同时间NF-κBp65从胞浆向胞核移位情况。Western blot(WB)法检测CK2、NF-κB信号通路中NF-κB p65、磷酸化p65、NF-κB抑制蛋白IκB、磷酸化IκB、IκB激酶IKK,凋亡相关因子bax及bcl-2,以及胰岛素转录关键因子PDX-1和Maf A的蛋白表达的变化。ELISA法检测胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)。结果:炎症因子(TNF-α+IFN-γ+IL-1β)联合作用可显著降低细胞活力,造成胰岛β细胞凋亡,细胞凋亡程度呈浓度及时间依赖。应用炎症因子处理MIN6细胞系72小时后,bcl-2的蛋白表达下降(P0.05),bax的蛋白表达升高(P0.05),提示炎症因子可能通过调节bax和bcl-2的表达来诱导胰岛β细胞的凋亡。在炎症因子诱导的胰岛β细胞凋亡模型中,发现IκB蛋白表达明显下降(P0.05),NF-κBp65蛋白表达降低(P0.05),磷酸化p65表达增加(P0.05),p65从胞浆向胞核移位。结果表明炎症因子作用下,IκB被激活后降解,促进p65的移位,从而激活NF-κB信号通路。在构建的胰岛β细胞凋亡模型中,PDX-1及Maf A蛋白表达水平显著降低(P0.05)。在正常MIN6细胞和MIN6凋亡模型中行GSIS试验,分别将上述两组细胞置于葡萄糖浓度为3.3mmol/L(低糖)和16.7mmol/L(高糖)的环境下,发现在低糖环境中,两组分泌的胰岛素水平未见显著差异,而在高糖环境中,凋亡模型组的胰岛素分泌水平显著低于对照组。证明炎症因子明显损伤胰岛β细胞在高血糖环境中分泌胰岛素的能力。通过siRNA降调CK2蛋白的表达后发现胰岛β细胞凋亡程度减少。抑凋亡因子bcl-2表达升高(P0.05)。表明抑制CK2能够减少胰岛β细胞凋亡。在NF-κB信号通路中,下调CK2后能够减少IκB的降解从而抑制IκB从三聚体中的解离;同时能够减少NF-κBp65从细胞浆移位到细胞核,证明下调CK2可抑制胰岛β细胞NF-κB信号通路的激活。在对胰岛β细胞功能的影响上,下调CK2后PDX-1和Maf A的蛋白表达较单纯炎症因子组升高,炎症因子导致的胰岛β细胞的GSIS下降得到部分缓解。说明抑制CK2的表达能够在一定程度上改善由于炎症因子作用所导致的胰岛β细胞功能的下降。结论:炎症因子可以通过激活NF-κB信号通路来诱导胰岛β细胞的凋亡。降调CK2能够抑制NF-κB信号通路的激活从而减轻胰岛β细胞的凋亡。


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