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子痫前期胎盘组织中差异蛋白质的表达及血清学标志物水平变化的研究

崔丽峰  
【摘要】:研究背景和目的:子痫前期(preeclampsia,PE)是一种发生在妊娠期特有的疾病,全球发病率约为2%-8%,在发展中国家有10%~15%的孕产妇死亡与此病相关。目前,在我国PE仍然是导致孕产妇、胎儿、新生儿发病率和死亡率增高的主要原因。PE表现为多种严重的症状,主要临床特征是妊娠20周后出现血压增高和/或蛋白尿,并可出现下列不良表现之一:血小板减少,肾脏功能异常,肝脏损害,肺水肿,脑神经症状或视觉障碍。多数PE发病的病情发展可以由轻到重呈现明显的病情进展性,但部分病例呈非典型病情过程,可在短时间内迅速发展,甚至直接出现严重并发症,危及母儿生命。还有一部分病例血压升高不明显,起病隐匿,在临床上常常诊断困难。迄今为止,PE尚无根治方法,终止妊娠和娩出胎盘是目前唯一有效的治疗措施。在没有治愈性治疗的前提下,早期及时准确诊断,确定有效干预治疗措施,延缓病情发展,保障母儿相对安全,成为临床实践中长期困扰产科医生的难题。为了对PE进行精准诊断及确定治疗方案,人们对其发病机制进行了一系列的研究,初步认为血管活性物质失衡、内皮功能紊乱、免疫因素、炎症反应以及氧化应激等相关途径因子可能与PE的发生发展有关。近年来有学者提出PE发病的二元理论:第一阶段在胎盘形成时,滋养细胞侵袭能力不足,浸润过浅,子宫螺旋动脉重铸障碍和胎盘浅着床,导致胎盘缺血。第二阶段由于胎盘缺血缺氧代谢障碍,胎盘来源的可溶性因子大量释放到母体血液循环中,引起广泛的母体血管内皮损伤,最终引起母体全身症状而引发PE。PE的发生是胎盘改变在先,随后继发母体出现一系列临床症状,二者具有相关性,提示胎盘的某些变化极有可能在PE患者血液中有所反应。对临床患者的研究受到社会伦理、实验观察指标、患者认可等诸多因素的影响,限制了PE的临床研究进展,在PE患者的胎盘和血液中筛选出能导致母体综合症状的特殊标志物一直以来是人们关注的热点。蛋白通路芯片技术(Protein Pathway Array,PPA)、Luminex技术等研究方法的发现,为我们提供了一个新的工具,推进了PE的临床研究。本学位论文以理论为基础,以临床患者为研究对象,首先利用PPA技术筛出胎盘组织中有差异表达的蛋白质,随即在这些蛋白质中选择部分相关的蛋白质,利用Luminex技术检测其在母体血清中的变化,结合临床资料及相关实验室检查,通过统计方法分析二者间的相关性,建立PE诊断模型及有严重不良表现子痫前期的预测模型,以期提高我们对PE准确诊断的能力以及对发生严重母儿并发症预测的能力。实验方法:1.病例选择:选择2011年7月至2012年6月就诊于吉林大学第一医院的166例择期剖宫产术孕妇,其中PE组101例,正常对照组65例。检测胎盘组织中差异蛋白的表达。选择2012年4月至2014年8月间在吉林大学第一医院分娩的病人共172例,其中PE组110例,正常对照组62例。将PE组分为两组,其中有严重表现的子痫前期(preeclampsia with severe features,PS)组25例,无严重表现的子痫前期(preeclampsia without severe features,PNS)组85例,检测母体血清中差异蛋白质的表达。所有患者均除外多胎妊娠,胎儿畸形,胎儿染色体异常,母体心血管病史,肾病史及其它与高血压相关的疾病史,妊娠前糖尿病,服用抗血小板药物、非甾体类消炎药物孕妇亦排除在本研究之外。2.采用PPA技术对PE和正常孕妇胎盘组织中的相关蛋白质进行检测,筛选和分析PE胎盘组织的差异表达蛋白质,进一步确定具有较强分类能力的蛋白质,并利用上述筛选出来的具有较强分类能力的蛋白质,分别就PE组和正常对照组进行Biometrics Research Branch(BRB)分层聚类分析。PPA技术是一种蛋白质组检测技术,以多通道Western-Blot技术为基础,同时融合了蛋白质组分析,SAM(Significant Analysis of Microarray)分析以及BRB-Array Tools统计分析,可以根据需要自行选择、组合目标蛋白抗体。3.根据胎盘组织中差异蛋白表达的结果选取11个血清学蛋白质标志物,应用Luminex技术及ELISA方法检测在PE组及对照组母体血清中的表达,并对PS组和PNS组临床参数及蛋白水平进行分析,建立PE诊断模型及有严重表现的子痫前期预测模型。Luminex技术是一种在ELISA基础上发展而来的新一代高通量分子诊断技术平台,它整合了荧光编码微球、激光检测、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运算法则等多项技术,能检测蛋白及核酸,具有高通量、操作简便、测量准确等优点,同ELISA相比,可以在一次实验中同时完成多个目标分子的分析。4.统计方法:应用SAM软件筛选PE组与正常对照组具有差异表达的蛋白质。应用BRB Array Tools v.3.3.0软件(htt://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)的K-fold cross validation(K=10)以及分层聚类分析方法,利用筛选出来具有差异表达的蛋白质对病例进行分类。应用student’s t-test进行差异蛋白质的筛选,应用卡方检验进行相关临床因素分析。非正态分布的数据转换为log2进行分析。应用单因素和多因素逻辑回归对蛋白质和临床病理学参数进行分析,产生伴有回归系数、P值、odd ratio(OR值)以及OR值的95%置信区间的独立预测因子,利用这些因子建立子痫前期诊断模型及伴有严重表现的子痫前期预测模型。应用SPSS 17.0(SPSS v17.0 software,SPSS Ins.,Chicago,IL)统计软件进行逻辑回归、ROC曲线分析,用Med-Calc统计软件(MedCalc statistical software,Mariakerke,Belgium)计算AUC曲线下面积,取P值0.05视为有统计学显著性。结果:1.应用PPA技术检测到64个(38.3%)蛋白质在胎盘组织中呈现阳性表达,其中36个(22%)蛋白质或磷酸化蛋白质在PE组与正常对照组呈差异性表达。在这36个蛋白质或磷酸化蛋白质中,19个蛋白质在PE胎盘组织中呈现高表达,包括Stat1,p-PKCδ,EGFR,AKT,HSP90,Calretinin,WT1,Factor XII IB,PSM,Endoglin,Nox4,Flt-1,Ebi3,HtrA,PAF,PBEF,Ptx3,PAI-1,TFPI2。17个蛋白质在PE胎盘组织中呈现低表达,包括PLGF,glypican3,nrf2,IGFBP3,Annexin XI,TFIIHp89,PDEF,ICAM-1,CREB,Bcl-6,NFκB p65,Bcl-2,14-3-3β,PCNA,Rap1,p-Stat3以及MAPK(Erk1/2)。其中在PE胎盘组织中有差异表达的Calretinin,Annexin XI,Ebi3是本实验首次确定并报道。2.在PE组中呈现差异表达的36个蛋白质或磷酸化蛋白质中又发现12个具有较强分类能力的蛋白质(Calretinin,HtrA,Endoglin,Nox4,PAI1,Ebi3,HSP90,Flt1,Ptx3,Annexin XI,PLGF,Bcl6),该组蛋白区分PE的准确性为89.5%,敏感度和特异度分别为93.1%和83.1%。3.根据胎盘组织中差异蛋白质表达的结果(sEndoglin,IL-27,PTX3,PLGF,PAI-1,sEGFR,sFlt-1)、现有抗体购置条件及相关文献(COX-2,human prolactin,VEGF,NGAL),共选取11个血清学蛋白质标志物,应用Luminex技术及ELISA方法检测,结果发现7个蛋白质在PE组有明显差异,其中VEGF,sEndoglin,sFlt-1显著增高,COX-2,PLGF,NGAL,sEGFR显著降低。在PS组sEndoglin及sFlt-1显著增高。4.分析比较胎盘组织及母体血清蛋白质的差异变化,结合临床资料结果,通过单因素及多因素回归分析及受试者工作特征曲线(ROC)分析,选择了包括VEGF,PLGF,sEGFR,sEndoglin 4种蛋白质的组合,建立PE诊断模型,曲线下面积为0.988,具有很高的诊断价值。应用此模型可以诊断子痫前期,尤其对血压正常,发病隐匿的患者,可以及时准确地做出诊断,并进行合理监测及治疗。5.在此基础上又建立了有严重表现子痫前期的预测模型:包括血清肌酐、sEndoglin,血小板计数。此模型对有严重表现的子痫前期具有较好的预测效能,曲线下面积为0.92。提示应用该模型可以对PE患者是否会发生严重母儿并发症进行预测和评估,为决定期待治疗或终止妊娠等临床治疗原则提供新的参考。6.我们实验结果证实,EGFR在PE患者胎盘组织中上调,sEGFR在PE患者血清中显著降低,其机制尚待进一步研究。统计分析证实血清中sEGFR水平可能作为子痫前期的独立预测因子,是对PE具有诊断意义的新的血清学标志物,其cut-off值为28.49ng/mL,特异性为87%,敏感性为55%,曲线下面积为0.724。结论:1.利用PPA技术在PE胎盘组织中筛选出与血管生成、内皮损伤、炎症、细胞增殖、免疫调节等机制相关的36个差异蛋白,首次发现胎盘组织中Calretinin,Annexin XI,Ebi3可能与PE的发生密切相关。2.根据胎盘组织中差异蛋白表达的结果及相关文献,应用Luminex技术及ELISA方法对PE患者血清进行检测,发现VEGF,sEndoglin,sFlt-1显著增高,COX-2,PLGF,NGAL,sEGFR显著降低。3.本研究发现PE组中sEGFR显著降低,sEGFR水平可能作为PE的独立预测因子,为进一步研究PE病理生理学机制奠定基础,同时也为PE风险的评估提供依据。4.利用Luminex技术确定的指标,采取多因素回归分析及受试者工作特征曲线(ROC)分析,本研究建立了VEGF,PLGF,sEGFR,sEndoglin 4种蛋白质组合模型,用于子痫前期的准确诊断,并利用血清肌酐,sEndoglin及血小板计数组合,建立了风险系数模型用于评估和预测有严重表现的子痫前期。


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