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DNA保护的银纳米簇与人乳头瘤病毒相关蛋白的作用研究

贾翔宇  
【摘要】:DNA保护的银纳米簇(AgNCs-dsDNA)通常由少于20个的银原子组成,具有超小尺寸、低毒、生物相容性好等优点。因此,AgNCs-dsDNA在光化学、生物成像、生物检测、生物传感等领域得到了广泛的关注。人乳头瘤病毒(HPV)是一类小型的、无包膜的、衣壳化的双链DNA肿瘤病毒,它会形成鳞状上皮乳头瘤;在乳头瘤中,病毒可以不断复制。目前已经超过200个HPV基因型完成测序,并将它们分为α、β、γ属等。α属的HPV型别主要感染黏膜或皮肤上皮细胞,而其它属的HPV型别主要感染皮肤细胞。感染黏膜的HPV型别可根据其致癌能力分为高危型(HR)和低危型(LR)。HPV是主要的人类致癌病毒,与全球大约4.5%的癌症的发病机率密切相关。HPV相关的致癌问题在未来几十年仍然相当严峻,人类迫切需要一些新的治疗方案和精准的检测手段来与之抗衡。因此,HPV的相关检测至关重要。HPV L1蛋白是HPV主要衣壳蛋白,人乳头瘤病毒粒子包含两种病毒编码的蛋白,即L1和L2,它们在病毒感染周期的后期被合成。LI蛋白占病毒粒子蛋白含量的90-95%,它可引起特异性中和抗体反应,从而保护接种动物不受后续感染,因此该蛋白可以作为预防接种的主要候选疫苗靶点。目前,市场上的预防性疫苗都是基于HPV L1主要衣壳蛋白所形成的VLPs,它们虽然不含DNA但在免疫学和形态学上却类似于原生病毒粒子。在高危型的HPV中,E6是一类主要的致癌蛋白。E6蛋白的长度约为100到150个氨基酸不等,是维持HPV阳性癌细胞恶性表型的关键因子。而且,E6和E7是HPV编码的两种致癌蛋白,这两种蛋白直接参与诱导致癌的过程。因此,HPV E6蛋白的检测对于癌症的预防和治疗具有重要意义。在本论文的第一部分,我们通过使用AgNCs-dsDNA和HPV主要衣壳蛋白L1构建了两个组装体系,分别为AgNCs@VLPs和VLPs@AgNCs。我们利用CsCl梯度离心,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等技术手段确定了组装体的形态和粒径大小。其中,AgNCs@VLPs的共组装体系可以诱导AgNCs-dsDNA的荧光大幅度增强,因此它提供了一种原位监测VLP的组装和解组装过程的荧光新方法;另外,该过程还可以在组装期间区分VLP衣壳的前期形成和后期熟化。因此,本部分研究不仅提出了一种银纳米簇的AILE现象,而且还提供了一种监测VLP的组装/解组装过程的新型荧光探针,这对于基于VLPs的HPV相关疫苗的改进具有重要意义。在本论文的第二部分,我们利用AgNCs-dsDNA实现了对HPV E6蛋白的体外检测。且通过对该检测方法的测试,我们计算得该方法的检出限为0.886 nM,和其它体外检测E6蛋白的方法相比,该方法灵敏度高(LOD=0.886 nM)、操作简单。除此之外,该检测方法还具有较好的抗干扰性和选择性,且可以实现对血清样品中E6的检测。因此,通过这一部分的研究我们不但进一步拓宽了AgNCsdsDNA的生物学应用;而且由于该方法的检测灵敏度极高,它对HPV相关癌症的早期诊断将具有重要意义。


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