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基于高通量测序技术对喉癌相关长链非编码RNA的初步筛选及鉴定

柴贵娟  
【摘要】:研究背景:喉癌(laryngeal carcinoma,LC)是头颈部常见的恶性肿瘤,在全身恶性肿瘤中约占5.7%~7.6%。在全球范围内,喉癌的发病率和死亡率分别为2.3/100 000和1.2/100 000~([1]),是严重威胁人类健康的一大杀手。然而,随着城市化、工业化以及人口老龄化的进程加快,高吸烟率和环境污染日益严重,我国喉癌的发病率有增高趋势~([2])。目前喉癌的诊断仍是通过患者的临床表现结合影像学特征、组织学检查结果等临床辅助检查手段来确诊,这些传统方式在一定程度上的局限性使得喉癌早期诊治变得困难。因此,通过揭示喉癌发病的分子机制,寻找可应用于临床的喉癌筛查和早期诊断的有效的肿瘤标记物,以提高喉癌早期诊断水平和防治效果已成为一项具有潜在临床价值的研究方向。以基因芯片及高通量测序技术(high-throughput sequencing)在近年来的迅猛发展,将转录组水平测序推向新台阶。研究发现占基因组95%以上的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)以多种机制广泛参与到人类肿瘤肿瘤的发展变化的各个过程,具有成为恶性肿瘤早期诊断和预后判断的分子标记以及分子靶向治疗靶点的潜在临床研究价值。目前喉癌相关lncRNA的研究方兴未艾,逐步建立lncRNA表达谱,探索特异lncRNA在喉癌发病机制,已经成为肿瘤研究领域中的新热点。目的:基于高通量测序技术通过对喉癌组织及癌旁组织长链非编码RNA差异性比较,筛选与喉癌发生、发展相关lncRNA,寻找潜在的喉癌相关性分子标记物。研究方法:1.基于高通量测序获得喉癌相关lncRNA表达谱,采用生物信息学手段对差异表达的lncRNA进行分析,筛选出喉癌与癌旁组织差异性表达的lncRNA。2.对差异表达的lncRNA与其相关基因生物学功能与参与的信号通路进行富集;根据lncRNA差异性表达倍数,筛选有显著差异的6个目的lncRNA。3.选取2017年11月-2018年9月于在吉林大学第二医院确诊为喉癌并于耳鼻咽喉头颈外科行喉癌切除手术并经我院病理科确诊为喉鳞状细胞癌的患者喉癌、对应癌旁标本,采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测其中8例喉癌组织、癌旁组织6个目的lncRNA表达趋势,根据RT-PCR结果选择差异表达趋势最明显的2个lncRNA在15对喉癌及癌旁组织中进行荧光定量qPCR验证。结果:1.经高通量测序,喉癌及对应癌旁组织相比,共有593个lncRNA具有差异性,其中差异性表达在4倍及以上lncRNA为312个,8倍及以上lncRNA为228个。从中选择6个具有显著表达差异的lncRNA作为后续验证的目标lncRNA,分别为NONHSAT244419.1,NONHSAT185102.1,NONHSAT176191.1,NONHSAT176190.1,NONHSAT176189.1,NONHSAT149828.1。2.在8对喉癌及癌旁组织中行RT-PCR验证,结果显示在喉癌及相应癌旁组织中lncRNA NONHSAT176190.1,NONHSAT176189.1具有较明显差异表达趋势;在15对喉癌及癌旁组织中行对lncRNANONHSAT176190.1,NONHSAT176189.1行qPCR验证,并行统计学分析,显示NONHSAT176190.1,NONHSAT176189.1与高通量测序结果具备同质性,在喉癌组织中表达下调。结论:1.基于高通量测序技术对喉癌lncRNA表达谱初步建立,与癌旁组织相比,具有大量的差异性lncRNA。2.应用高通量测序技术对喉癌及癌旁组织测序,提供大量转录组水平的肿瘤相关数据,有助于发现新的喉癌标志物及相关发生机制。3.NONHSAT176190.1,NONHSAT176189.1在喉癌、癌旁组织中差异性表达,且在喉癌组织中表达下调,提示可能与喉癌肿瘤进程相关。


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