核基因组编码lncRNA MALAT1通过异常穿梭调控肝癌细胞线粒体代谢—凋亡—自噬的机制研究

【摘要】：研究背景:肝细胞癌是在世界范围内最常见的肿瘤之一,其死亡率在全球范围内排第三。每年约有434000新发病例。HCC的发生与肝炎病毒感染、肝脏纤维化等因素密切相关,而在此发生过程中,炎症和氧化应激产生的活性氧ROS发挥了重要作用。此外,HCC细胞OXPHOS系统异常不仅使其能量代谢功能异常,而且会进一步增加ROS的产生,ROS通过氧化修饰和激活Ras/Raf、MAPK、P38等信号通路促进HCC的发展。因此,OXPHOS系统的损害和过量的ROS的产生是HCC发生发展中的重要因素。线粒体代谢重编程被认为是新一代肿瘤的新兴重要特征之一。线粒体作为重要的细胞应激传感器,是OXPHOS系统产生ATP、ROS以及触发细胞凋亡级联反应等一系列过程的重要执行者。在20世纪30年代,“Warburg效应”的提出奠定了线粒体在肿瘤代谢改变中的重要作用。近年来线粒体代重编程被认为是肿瘤发生发展生存的重要环节。肿瘤能量代谢缺陷,特别是线粒体缺陷,与癌症的发生或发展密切相关。最近的报道表明,在线粒体中也存在核编码的lnc RNA,这些lnc RNA与转录因子和表观遗传调节因子一起协同调节线粒体基因表达和线粒体功能。在最新的研究中,MALAT1(转移相关肺腺癌转录物1)被发现高度富集在肝细胞癌Hep G2的线粒体中。MALAT1是一种高度保守的核编码的lnc RNA,参与多种人类肿瘤的侵袭转移。MALAT1是如何穿梭到线粒体中,富集于线粒体中,MALAT1是否调节线粒体功能,MALAT1又是如何参与肿瘤线粒体重编程至今尚未被阐明。目的意义:1.验证lnc RNA MALAT1是否通过穿梭转运蛋白运输至线粒体内,从空间上联系起主要调控作用的核基因和半自主调控的线粒体基因。2.验证MALAT1是否参与肿瘤细胞线粒体代谢,是否参与线粒体mt DNA的复制与转录,以及其如何对线粒体基因组进行表观遗传学等修饰过程,以及其是否干预线粒体结构的重塑、代谢功能的重编程、氧化还原信号改变、线粒体凋亡、线粒体自噬等,从而影响HCC的发生发展。3.从理论上为MALAT1调控机制的研究提供新维度,为线粒体与细胞核的对话方式提供新线索,从应用策略上探索线粒体中MALAT1作为HCC新的肿瘤分子标志物和治疗靶点可能性,为HCC的诊断和靶向治疗研究提供新的思路。方法:1.在肝细胞癌细胞系Hep G2和正常肝细胞系HL7702进行线粒体的提取,以及RNA测序,以发现在肝细胞癌和正常肝细胞中差异表达的线粒体富集的lnc RNA。2.通过“RNA逆转录相关捕获测序”(RAT-seq),RNA免疫沉淀(RIP),荧光原位杂交(FISH)探索与MALAT1起相互作用蛋白和DNA,以及可视化MALAT1在线粒体中的分布。3.通过sh RNA的方法沉默MALAT1后,使用Seahorse代谢检测仪,ATP检测试剂盒,mito SOX染色,线粒体SOD活性检测试剂盒,lysotracker染色,流式细胞仪(Annexin V/7-AAD染色),免疫印迹和电子显微镜来检测MALAT1敲低细胞系的代谢,ROS量,线粒体自噬,细胞凋亡和线粒体形态变化。4.通过sh RNA稳定干涉MALAT1的表达,并通过CCK-8实验、Transwell小室实验、疤痕形成实验和平板克隆形成实验,评估MALAT1对肿瘤细胞增殖、肿瘤克隆形成能力、肿瘤细胞周期、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移等的影响。结果:1.通过线粒体-RNA转录组测序与FISH相结合,我们发现核基因组编码的与肿瘤转移相关的lnc RNA MALAT1富集在Hep G2细胞的线粒体中。2.使用RAT-seq方法,我们发现MALAT1 lnc RNA与线粒体DNA的多个位点(MT-RNR1,MT-RNR2,MT-COX2,MT-ND3,MT-CYTB)相互作用。3.RIP和RNA测序表明:RNA结合蛋白Hu R介导MALAT1由细胞核向线粒体的转运。此外,发现线粒体跨膜蛋白线粒体载体2(MTCH2)与MALAT1相互作用,表明MALAT1可能通过MTCH2进入线粒体内部。4.敲除MALAT1诱导线粒体功能的多种异常,包括线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)减弱,ATP产生减少,mt DNA拷贝数降低,线粒体ROS合成减少,线粒体SOD酶活性增强,线粒体自噬减弱和线粒体凋亡途径的激活。5.MALAT1对细胞增殖、克隆形成、细胞周期并未产生明显影响、MALAT1敲除后Hep G2细胞侵袭、迁移能力明显下降。结论:本实验通过线粒体转录本高通量测序首次鉴定了线粒体中存在的大量行发现的核编码RNA,揭示了lnc RNAs作为细胞器间信号传导分子的新生物学功能。本研究提示细胞器之间lnc RNA异常穿梭或是参与细胞恶性转变的重要机制。研究发现核基因组编码lnc RNA MALAT1相比正常肝细胞HL7702,高度富集在肝细胞癌Hep G2细胞的线粒体中。揭示了在肝细胞恶性转化中,MALAT1参与细胞核与线粒体异常穿梭的新调节机制。本研究证实MALAT1影响线粒体DNA转录复制的机制:MALAT1与线粒体的多个位点(MT-RNR1,MT-RNR2,MTCOX2,MT-ND3,MT-CYTB)相互作用,敲除MALAT1后影响线粒体基因组复制,线粒体基因组结合区域Cp G3的甲基化水平,引起线粒体基因转录水平降低。除此之外,本研究揭示MALAT1穿梭的可能机制:MALAT1结合蛋白Hu R,Hu R具有携带RNA出细胞核的功能,Hu R或介导MALAT1由细胞核向线粒体的转运。此外,发现线粒体跨膜蛋白线粒体载体2(MTCH2)与MALAT1相互作用,表明MALAT1可能通过MTCH2进入线粒体内部。同时本研究阐明敲除MALAT1诱导线粒体多种功能异常:包括线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)减弱,ATP产生减少,降低mt DNA拷贝数,线粒体ROS合成减少,线粒体SOD酶活性增强,线粒体自噬减弱和线粒体凋亡途径的激活。