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CA4聚合物纳米颗粒联合索拉菲尼对H22肝癌抑制作用的研究

王雅琳  
【摘要】:研究背景:在世界范围内,肝癌在癌症发病率中排名第6位,肿瘤死亡率中排名第2位,其中超过一半的新发和死亡病例发生在中国。由于早期诊断、疾病进展迅速等方面的困难,肝癌的存活率非常低。手术和肝移植是肝癌患者最佳的治疗手段,但不可切除肝癌的临床治疗仍然是一个挑战。最近,一项临床试验结果表明,动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolisation,TACE)和索拉非尼(sorafenib,SRF)联合治疗可以显著改善不可切除肝癌患者的无进展生存期(progression-free survival,PFS)。但TACE是一种局部治疗手段,对晚期或转移性肝癌的治疗效果欠佳。目的:本研究制备了盐化的CA4/聚(L-谷氨酸)接枝聚(乙二醇)纳米粒(CA4-NPs),CA4-NPs可以破坏肿瘤脉管系统,导致血管阻塞,机制上类似于TACE造成的血管栓塞,同时CA4-NPs经静脉给药,可以达到全身治疗的效果。本文通过构建H22肝癌移植瘤模型,通过一系列体内实验,来探讨CA4-NPs联合索拉非尼对肝癌的治疗效果、安全性及简单作用机制。方法:制备CA4-NPs纳米颗粒,并进行基本的药物表征。构建H22肝癌皮下移植瘤模型,设立不同治疗组(PBS、CA4-NPs、索拉非尼、索拉非尼+CA4-NPs),通过监测肿瘤体积、小鼠生存期、HE染色、Ki-67免疫组化等评估各治疗组的抗肿瘤效果;通过监测小鼠体重变化、血清肝肾功能以及主要脏器病理结果评估药物毒性;CD31免疫组化分析肿瘤血管情况;检测VEGF-A的表达水平探讨可能的药物作用机制。最后,建立H22肝癌原位移植瘤模型,验证CA4-NPs联合索拉非尼在原位肝癌模型中的治疗效果。结果:1.成功制备CA4-NPs,药物表征结果如下:载药量18.54%,游离CA4含量2.0%;DLS(动态光散射仪)测得CA4-NPs平均流体力学半径为42.9 nm。2.当CA4-NPs给药浓度为20 mg·kg~(-1)(按CA4计算)时,H22皮下肝癌模型的抑瘤结果:(1)肿瘤体积或肿瘤抑制率:与PBS组相比,CA4-NPs和索拉非尼组均能显著地抑制肿瘤增长,且联合组治疗效果最佳。治疗第14天,CA4-NPs组(33.0%)和索拉非尼组的肿瘤抑制率(TSR%)分别为33.0%和54.7%,联合组的TSR%为81.6%,显著高于CA4-NPs组和索拉非尼组。(2)生存期:四个治疗组(PBS、CA4-NPs、索拉非尼、索拉非尼+CA4-NPs)的中位生存期分别为23天,24天,29天和42天。与PBS组相比,CA4-NPs组并未提高荷瘤鼠生存期,但索拉非尼组和联合给药组可以明显提高荷瘤鼠生存期。(3)HE染色测得肿瘤坏死面积:CA4-NPs组和索拉非尼组的坏死面积分别为(46.8±3.3)%和(44.6±0.5)%。联合治疗组的坏死率最高,可达(86.9±5.6)%。(4)Ki-67免疫组化:PBS组Ki-67阳性表达量最高,其次为索拉非尼组和CA4-NPs组,联合给药组表达量最低。3.当CA4-NPs给药浓度为20 mg·kg~(-1)(按CA4计算)时,H22皮下肝癌模型的毒性结果:(1)小鼠体重变化率:体重下降均未超过20%。(2)肝肾功能:荷瘤鼠PBS组与其他3个给药组(CA4-NPs、索拉非尼、CA4-NPs+索拉非尼)相比,血清AST水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05);但3个给药组与正常小鼠比较,AST水平无统计学差异(P0.05)。各组ALT和BUN无统计学差异。(3)脏器HE染色:无明显脏器损伤。4.CD31免疫组化结果:(1)与给药前对比,CA4-NPs给药2天后,CD31表达水平明显下降;给药第7天后,CD31仍保持在较低水平,明显低于第0天的CD31表达水平;但第14天时,CD31表达明显升高。(2)H22皮下肝癌小鼠在治疗结束后,各组的CD31表达情况:与PBS相比,CA4-NPs组CD31表达水平明显升高,索拉非尼组较PBS组下降,联合治疗组CD31表达水平最低。5.VEGF-A蛋白表达:治疗第14天,与PBS组相比,CA4-NPs组VEGF-A表达增加;索拉非尼给药后可明显抑制VEGF-A的表达,表达量最低。VEGF-A在联合给药组的表达要明显低于CA4-NPs组。6.增加CA4-NPs浓度至30 mg·kg~(-1)(按CA4计算)或35 mg·kg~(-1)(按CA4计算),我们继续检测了CA4-NP(30 mg·kg~(-1))、CA4-NPs(35 mg·kg~(-1))、索拉非尼+CA4-NPs(30 mg·kg~(-1))、索拉非尼+CA4-NPs(35 mg·kg~(-1))四个治疗组的肿瘤抑制率、小鼠体重变化和生存期等指标,结果如下:(1)肿瘤抑制率:4个药物治疗组肿瘤增长缓慢,肿瘤负荷明显减少。治疗第14天,两个CA4-NPs单药组的肿瘤抑制率分别是51.7%(CA4终浓度30 mg·kg~(-1))和95.3%(CA4终浓度35 mg·kg~(-1));两个联合给药组的肿瘤抑制率分别为92.9%(CA4终浓度30mg·kg~(-1))和93.7%(CA4终浓度35 mg·kg~(-1))。(2)小鼠体重变化率:各组小鼠体重下降均未超过20%,且给药过程中未发生小鼠死亡。(3)生存期:从给药第1天算起,共观察90天,CA4-NPs单药组的小鼠中位生存期分别为24天(CA4终浓度30 mg·kg~(-1))和40天(CA4终浓度35 mg·kg~(-1));两个联合给药组的中位生存期均未达到,且观察期结束时,两联合治疗组均有71.4%的小鼠无瘤生存。7.通过构建H22肝癌原位移植瘤模型,对CA4-NPs联合索拉非尼的治疗效果进一步验证,结果如下:与PBS组对比,CA4-NPs和索拉非尼单药均可抑制肿瘤细胞生长,肿瘤质量低于PBS组;联合治疗组肿瘤最小,质量最轻。HE染色结果提示,联合给药组肿瘤坏死面积最大,两个单药组次之,对照组坏死面积最小。结论:1.成功制备高溶解性的CA4聚合物纳米颗粒。2.H22肝癌皮下移植瘤体内实验证实,CA4-NPs联合索拉非尼可以抑制荷瘤鼠肿瘤生长,延长生存期。3.CA4-NPs和索拉非尼单药或联合治疗对荷瘤鼠无脏器损伤。4.CA4-NPs早期可快速降低微血管密度,且药效至少维持1周。但后期会诱导微血管密度升高,联合索拉非尼可逆转CA4-NPs诱导的复发性微血管密度升高,降低微血管密度。5.CA4-NPs单药治疗后期会诱导VEGF-A表达升高,联合索拉非尼可抑制CA4-NPs诱导的VEGF-A表达升高,延缓复发。6.CA4-NPs联合索拉非尼在原位肝癌模型中也可发挥有效的抗肿瘤作用。


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