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静电纺聚己内酯复合纤维在血管组织工程中的潜在应用

李玉梅  
【摘要】:随着生活水平提高,社会人口老龄化已经成为一种趋势,造成老龄化人群死亡的主要元凶之一为心血管疾病。动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病,它会导致内膜层下斑块的形成,减少血液流动的横截面积,从而导致流向斑块下游组织的血液减少,对人类健康具有极大的危害。临床主要采用药物治疗,严重者则需要支架或旁路移植等手术治疗。大口径血管移植临床已取得较好的效果,但小口径血管的移植仍然存在远期通畅率不高,易闭塞等弊端。理想的血管移植物为自体血管,但取材有限。因此,能够满足天然血管机械性能且具有生物相容性和血液相容性的人工血管成为研究的焦点。目前,多种血管材料已被研究者们不断的开发研究,而如何通过功能改性促进内皮化,提高远期通畅率,抗血栓生成,依然是需要探索且持续研究的课题。近年来,静电纺丝技术在血管组织工程中脱颖而出。静电纺丝技术制备的微(纳)纤维因具有简单易操作,孔隙率高,结构与天然细胞外基质(ECM)相似等优点,已被广泛研究并用于制备组织工程血管。基于上述内容,本论文主要以聚己内酯(PCL)为研究对象,通过制备功能化电纺纤维促进内皮化及增强抗凝性能,并研究它们的细胞相容性、血液相容性以及促进血管生成的能力,旨在制备同时具有促进内皮细胞增殖及抗凝性能的人工血管材料,为血管组织工程新型材料的开发做出贡献。具体内容如下:1.聚苯胺(PANI)由于具有优良的导电性、良好的氧化还原稳定性、可逆氧化性和生物相容性,被认为是组织工程和再生医学的潜在候选物。PANI独特的电刺激响应性,对细胞的多种功能,如黏附、增殖、迁移和分化等具有调节作用。故而,我们通过静电纺丝法制备导电PANI-PCL纤维,为电刺激提供基础,从而研究电刺激与导电PANI-PCL纤维对内皮细胞功能的耦合效应。(1)首先通过静电纺丝技术制备了PCL电纺纤维,为了提高PCL的亲水性,经等离子体处理后,通过原位氧化聚合法在PCL表面包覆PANI,制备具有导电性的PANI-PCL纤维。通过SEM、XPS、FT-IR测试,证明PANI成功包覆于PCL表面,导电率为6.71×10~-33 S/cm,为研究电刺激响应性提供了基础。拉伸测试显示,PANI-PCL纤维的拉伸强度增加至3.51 MPa,断裂伸长率为110.45%,能够满足血管力学要求。在亲水性测试中,PANI-PCL与PCL相比具有更好的亲水性,有利于细胞。(2)为了观察纤维的细胞相容性及电刺激响应性,以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象,通过活细胞染色技术及MTT法测定细胞增殖,采用荧光染色和SEM测试,观察细胞增殖和形态的变化。PANI-PCL纤维与PCL纤维比,HUVECs表现出较强的黏附力和增殖。在电刺激作用下增殖效果更佳。HUVECs在PANI-PCL纤维上的增殖与电刺激强度密切相关,其中400 mV/cm刺激作用相对较好。研究结果为导电材料在血管组织工程的研究提供了新的思路。2.为了进一步提高PCL的抗凝及促进血管内皮细胞增殖的作用,我们选择了同时具有抗凝及促进内皮细胞增殖作用的阿魏酸(FA)为功能改性原料,通过混纺的方式,制备了FA-PCL纤维。观察该功能化纤维的促血管新生及抗凝血性能。(1)将不同质量分数的FA(FA质量分数分别为PCL的3%,5%,10%)与PCL混合,采用静电纺丝法制备FA-PCL纤维。对所制备的载药纤维进行形貌表征及性能测试。从纤维形貌上看,FA-PCL仍保持着纤维结构,但3%FA-PCL及5%FA-PCL纤维直径均匀性不佳,这一点也影响了纤维的拉伸性能,导致3%FA-PCL、5%FA-PCL纤维拉伸强度降低,但仍可满足天然血管的力学要求。而随着FA质量的增加,10%FA-PCL纤维相对较均匀,拉伸强度与PCL相比略有增加。亲水性测试中,FA-PCL各纤维与PCL相比,接触角无明显变化,仍表现出明显的疏水性。体外药物释放中发现释放初期药物存在明显突释现象,这可能是由于纤维表面附着药物所致,随着FA质量分数的增加,释放速度加快,药物释放机理主要为扩散释放机制。(2)选用HUVECs细胞作为细胞相容性的研究对象,采用Calcein-AM对活细胞进行染色、CCK-8法测试细胞增殖、荧光染色及SEM对细胞的黏附、增殖及形态进行观察。负载阿魏酸的PCL纤维,有利于内皮细胞的增殖,培养5天后,5%FA-PCL对细胞的增殖作用最为明显(p0.01)。采用载药纤维的浸提液分别进行基质胶体外成管实验以及划痕法体外迁移实验观察载药纤维促进血管生成能力,结果显示,FA-PCL纤维与PCL相比具有促进内皮细胞管状结构形成及增强细胞迁移能力的作用,其中3%FA-PCL,5%FA-PCL作用较好,而10%FA-PCL可能由于FA含量较高,抑制了细胞的成管及迁移能力。(3)对所制备的载药纤维进行溶血实验以及复钙实验、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)抗凝实验,以考察其血液相容性。FA-PCL各纤维溶血率符合国家标准,溶血率均小于5%。抗凝实验中,FA-PCL纤维表现出优良的抗凝性能,且随着FA含量的逐渐增加,抗凝作用增强。3.通过前两章实验结果发现,PANI-PCL在有、无电刺激作用下均可促进细胞的增殖,阿魏酸可提高抗凝性能及促进血管新生,但在药物释放研究过程中,存在突释现象。基于上述实验结果,我们将聚苯胺、阿魏酸同时用于聚己内酯的改性,以达到两者协同促进血管新生及抗凝作用,利用所包覆的导电PANI,延长药效时间。(1)通过混纺制备不同载药量的FA-PCL纤维,等离子体处理后,纤维表面包覆PANI。通过细胞相容性测试、成管实验、迁移实验、溶血实验、抗凝实验,筛选出PANI-10%FA/PCL纤维具有明显的促进血管新生及抗凝作用。(2)依据实验优选的最佳载药导电纤维为PANI-10%FA/PCL,按其药物配比,首先进行管状10%FA-PCL血管移植体的制备,所制备的10%FA-PCL血管支架,依然采用等离子体处理,然后,表面包覆导电高分子PANI,制备导电载药血管移植体。通过置换家兔颈总动脉血管,观察该血管移植体的通畅率及血管组织变化。在体血管置换15天后,PANI-10%FA/PCL纤维通畅率约为77%,管壁内可见附着物,材料和管壁贴合。而PANI-PCL通畅率约为55%,管腔内可见血栓机化,材料周围被结缔组织包绕,伴炎细胞浸润。在血管内皮检测中发现,内皮化不理想,PANI-10%FA/PCL上仅有少量细胞出现CD31的阳性表达。


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