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异土木香内酯通过ROS介导的DR5上调诱导食管癌细胞凋亡的研究

路正阳  
【摘要】:背景:食管癌(Esophageal carcinoma)是常见的消化道恶性肿瘤,也是严重影响人类健康的疾病之一。近些年,食管癌发病率逐年升高,每年新发病例超过45万人。尽管目前食管癌的治疗方法多种多样,包括内镜治疗,手术治疗,化疗药物治疗和放射治疗等多种方法,然而食管癌的五年生存率只有15%-25%。因此,为了提高食管癌治疗的有效率以及改善食管癌患者的预后,开发新的食管癌治疗药物变得尤为重要。程序性细胞死亡(PCD)是受调节的细胞死亡形式,可以在细胞存活和死亡的平衡中起到调节作用。到目前为止,已经有多种程序性细胞死亡方式被发现,包括凋亡(apoptosis),自噬性细胞死亡(autophagy),程序性坏死(necroptosis)和铁死亡(ferroptosis)等。诱导程序性细胞死亡来抑制肿瘤细胞的增殖一直是肿瘤治疗的重要策略。细胞凋亡是最早发现的也是被研究最多的程序性细胞死亡形式。细胞凋亡的失调会导致各种疾病的发生,包括癌症,自身免疫疾病和神经退行性疾病等。半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化以及其对细胞内重要的蛋白的水解是凋亡发生的核心环节。根据功能不同,caspase分为启动型caspase包括caspase-2/8/9/10,和执行型caspase包括caspase-3/6/7。启动型caspase受到其上游信号分子的激活,并随后剪切活化执行型caspase,最终执行型caspase在细胞内起刽子手的作用水解底物诱发最终的凋亡反应。最常见的凋亡途径是外源性凋亡和内源性凋亡,两者都能将凋亡信号逐步向下传递直至caspase活化。内源性凋亡主要受bcl-2家族蛋白调节,bcl-2家族的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间动态变化及相互作用可以调节线粒体膜的通透性从而使线粒体内的凋亡介质释放到细胞质内激活凋亡发生。细胞色素c(Cyto-c)是线粒体释放到细胞质中最重要凋亡诱导因子,在细胞质中Cyto-c与caspase-9,Apaf-1结合形成凋亡复合小体剪切活化caspase-9,caspase-9再剪切活化caspase-3/7诱发最终凋亡反应。外源性凋亡由死亡配体与死亡受体结合触发,常见的死亡受体有TNFR1,Fas,和death receptor(DR)4/5等。死亡受体激活时引起其自身寡聚化,继而和衔接蛋白结合形成死亡诱导信号复合物(DISC),并进一步剪切活化caspase-8/10。活化的caspase-8/10既可以剪切促凋亡蛋白Bid使其活化片段tBid转位到线粒体外膜而诱发内源性凋亡,也可以直接剪切活化caspase-3/7而诱导凋亡。肿瘤细胞对凋亡抵抗是肿瘤发生发展的一个重要原因。开发促进肿瘤细胞凋亡的化疗药物也一直都是肿瘤治疗的热点。异土木香内酯是从Inula helenium L中提取出来的倍半萜烯内酯类小分子化合物,具有良好的药用价值,包括抗炎,抗菌和抗癌等。异土木香内酯的抗肿瘤作用一直是其最受关注的研究方向,很多研究也显示了其作为抗肿瘤药物具有良好的效果。但目前为至,关于其抗肿瘤具体的分子机制远为被阐明清楚。因此,我们探索了异土木香内酯对食管癌细胞的抗癌作用,并进一步深入研究异土木香内酯抗肿瘤的分子机制。目的:利用人类食管癌细胞和食管癌裸鼠移植瘤模型研究异土木香内酯对食管癌细胞的作用及其分子机制。方法:1.CCK-8检测细胞生存率。2.平板克隆法检测增殖情况。3.光学显微镜观察细胞形态变化。4.Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞核变化。5.Annexin V-FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。6.SiRNA敲除DR5基因研究其在异土木香内酯对食管癌细胞影响中的作用。7.DCFH-DA探针染色荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内ROS含量。8.建立食管癌裸鼠移植瘤模型,测量记录肿瘤大小及裸鼠体重。9.HE染色观察小鼠脏器和肿瘤组织病理改变。10.免疫组化检测cleaved PARP在肿瘤组织中表达。11.TUNEL实验检测肿瘤组织内凋亡情况。12.Western blot检测细胞和肿瘤组织内蛋白的表达结果:1.异土木香内酯作用24h和48h能够以浓度依赖的方式显著降低食管癌细胞(ECA109,EC9706,TE-1和TE-13)的生存率。同ECA109和EC9706细胞相比,异土木香内酯对人正常肝细胞L-O2的毒性较轻。平板克隆实验显示异土木香内酯显著影响了食管癌细胞长期增殖能力。光镜观察发现异土木香内酯处理后,食管癌细胞细胞变圆皱缩,并随着浓度增加,部分细胞漂浮在培养液中。2.细胞凋亡,细胞自噬,程序性坏死和铁死亡各自的抑制剂预处理食管癌细胞后,只有凋亡和铁死亡的抑制剂显著缓解异土木香内酯导致的食管癌细胞生存率下降。3.Hoechst33342染色发现异土木香内酯处理导致食管癌细胞细胞核出现染色质凝集的高亮染色和细胞核碎裂的现象。流式细胞仪检测异土木香内酯可以呈浓度依赖的方式诱导食管癌细胞发生凋亡,并且被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK逆转。4.western blot检测发现异土木香内酯对bax,bcl-2,caspase-9,cleaved caspase-8,cleaved caspase-9,bid和t-bid等蛋白表达无显著影响,但可以下调caspase-3/7,caspase-10和PARP表达,同时上调cleaved caspase-7,cleaved PARP和DR5表达。5.qPCR检测发现DR5敲除组DR5mRNA表达显著低于阴性对照组。DR5敲除能够减轻异土木香内酯诱导的食管癌细胞生存率下降和凋亡。6.荧光显微镜和流式细胞仪检测显示异土木香内酯显著上调食管癌细胞内ROS含量,并且能被ROS抑制剂NAC逆转。NAC能够逆转异土木香内酯诱导的食管癌细胞生存率下降和凋亡。7.异土木香内酯能抑制食管癌移植瘤的生长,并且对小鼠体重无明显影响。HE染色显示异土木香内酯对小鼠心肝脾肺肾等脏器无明显影响,但可以显著破坏小鼠移植瘤组织结构。TUNEL实验显示异土木香内酯能诱导肿瘤组织凋亡。免疫组化结果显示异土木香内酯增加肿瘤组织内cleaved PARP的表达。Western blot结果显示异土木香内酯上调肿瘤组织内DR5和cleaved caspase-7表达。结论:1.异土木香内酯能够显著降低食管癌细胞生存率和长期增殖能力,但对人正常肝细胞毒性较小。2.异土木香内酯可以通过上调DR5受体诱导食管癌细胞发生caspase依赖的外源性凋亡。3.异土木香内酯能够上调食管癌细胞内ROS含量,并且ROS含量的上调介导了异土木香内酯诱导的食管癌细胞凋亡和增殖抑制。4.异土木香内酯可以抑制食管癌移植瘤在裸鼠皮下的生长,并且诱导肿瘤组织凋亡,但对裸鼠没有明显毒副作用。


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