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维生素D介导的Th17/Treg细胞稳态调节对孤独症大鼠肠道菌群失调作用的研究

杜琳  
【摘要】:孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD),简称ASD,是一组以社交障碍、兴趣或活动范围狭窄,语言交流障碍,以及重复刻板行为为主要特征的神经发育障碍性疾病,一般发病于3岁之前。近几十年来,ASD患病率逐渐增高。2014年,美国孤独症和发育残疾监控中心发布的数据显示,ASD的患病率高达14.7/1000,相当于68例儿童中即有1例ASD患儿。目前,ASD已经被世界卫生组织界定为全球发病率增长最快的严重疾病之一,成为影响人口健康的全球重大公共卫生问题。ASD病因尚不明确,推测由遗传因素和环境因素共同作用导致发病。治疗上以行为干预、特殊教育为主,目前还没有针对核心症状的特效治疗药物。探索ASD的病因并寻求有效的药物成为人们日益关注的重点。ASD儿童存在免疫系统功能紊乱,外周血中CD8~+T和CD4~+T细胞数量增多,Treg细胞受到抑制,Th17活性增加,细胞因子如肿瘤生长因子β1、单核细胞趋化蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白1增高。同时,ASD儿童炎症性肠病和其他胃肠道紊乱患病率高于正常发育儿童,肠道脆弱拟杆菌属、梭菌属、鲍氏梭状芽孢杆菌等多种菌属与正常人群有明显差异。肠道菌群紊乱可基于脑肠轴的原理,自下而上通过神经免疫和神经内分泌机制影响中枢神经系统机能。Th17/Treg细胞平衡可能是维持正常的机体整体免疫功能和肠道免疫屏障功能中关键的因素。维生素D是人体重要的必需营养素之一,其受体分布人体许多重要器官。维生素D不仅可以调节钙磷代谢,还与自身免疫性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等密切相关,并可能作为一种神经保护剂保护大脑皮层神经元避免兴奋性毒性。此外,维生素D还可以调解Th细胞以及Treg细胞功能,可抑制Th17细胞,并促进Treg细胞的增殖。大量研究证实,ASD儿童的维生素D水平低于同龄健康人群,并且足量、规范地补充维生素D可改善其ASD核心症状,但治疗作用机制不明确。综上,我们假设维生素D通过影响Th17/Treg细胞平衡调节ASD肠道的菌群紊乱,进而通过脑肠轴作用改善神经系统的发育。本研究将实验动物分为control组(对照组)、ASD-N组(ASD模型非干预组)、ASD-D组(ASD模型经维生素D干预组),通过对三组大鼠的生长发育、ASD样行为、Th17/Treg细胞平衡、细胞因子、肠道菌群、前额叶GABA和5-HT水平、外周血GABA和5-HT水平和结肠5-HT水平进行检测,明确维生素D介导的Th17/Treg细胞稳态调节对ASD大鼠肠道菌群失调的改善作用。第一部分建立VPA ASD大鼠模型目的:成功构建ASD大鼠模型,为后续实验做准备。方法:将孕龄Wistar雌鼠与雄鼠合笼,阴道涂片见到精子记录为孕第1天,大鼠在孕12.5天分为两组,对照组给予单次腹腔注射100μL生理盐水,模型组给予单次腹腔注射VPA(600mg/kg)。仔鼠出生后选择对照组10只雄性仔鼠作为对照组。将模型组的10只雄性仔鼠作为模型组。对两组大鼠生后第7、12、21、35和42天进行体重检测,生后第12~16天记录睁眼时间,生后第8、10、12和16天进行游泳评估,生后第21、32和42天进行自我梳理测试,生后第30天进行嗅觉适应/去适应实验,生后第42天进行社交互动测试。结果:模型组大鼠与对照组相比,发育早期体重明显减轻(p0.001)、睁眼明显延迟(p0.01)、游泳表现明显落后(p0.05)、重复理毛时间明显延长(p0.05)、对同类嗅觉敏感度明显下降(p0.05)以及社交互动时间明显减少(p0.05)。结论:Wistar母鼠孕12.5d腹腔注射VPA可以诱导雄性子代出现ASD特征性症状,实验成功复制稳定的ASD动物模型。第二部分维生素D对ASD大鼠的治疗作用目的:确定维生素D对ASD大鼠的治疗作用。方法:建模方法同第一部分,设立control组(对照组)、ASD-N组(ASD模型非干预组)、ASD-D组(ASD模型经维生素D干预组)。ASD-N组和control组于仔鼠生后第12天接受单次100μL生理盐水肌肉注射,ASD-D组于仔鼠生后第12天接受单次80,000IU/kg的维生素D_3肌肉注射。对三组大鼠生后第7、12、21、35和42天进行体重检测,生后第12~16天记录睁眼时间,生后第8、10、12和16天进行游泳评估,生后第21、32和42天进行自我梳理测试,生后第30天进行嗅觉适应/去适应实验,生后第42天进行社交互动测试,生后第45天采用高效液相色谱法进行血清25-OH-D_3的测定。结果:与ASD-N组相比,ASD-D组的体重明显增加(p0.001),睁眼时间提前(p0.01),游泳表现更好(p0.01),接近control组(p0.05)。与ASD-N组相比,ASD-D组的自我梳理时间缩短(p0.05)、对同伴嗅觉敏感度提高(p0.001)和社交互动表现增多(p0.01)。ASD-N组的血清25-OH-D_3水平明显低于control组(p0.05),血清25-OH-D_3水平与生后42天的自我梳理时间呈负相关(p0.05)。ASD-D组的血清25-OH-D_3水平明显高于ASD-N组(p0.01)。结论:维生素D可促进ASD大鼠生长发育、改善ASD样行为表现。ASD大鼠发育后期的重复行为随维生素D水平的降低而加重。第三部分维生素D治疗ASD大鼠的机制研究目的:探讨维生素D治疗对ASD大鼠的Th17/Treg细胞平衡、肠道菌群、前额叶GABA和5-HT水平、外周血GABA和5-HT水平和结肠5-HT水平的影响。方法:建模、分组同第二部分,生后第45天,10%水合氯醛麻醉大鼠,分别采集外周血、前额叶和结肠。采用流式细胞方法检测三组大鼠的Treg细胞和Th17细胞比例,采用ELISA方法检测三组大鼠血清IL-17、IL-6和IL-23水平、前额叶和外周血GABA和5-HT水平、结肠5-HT水平,采用高通量测序法对三组大鼠肠道菌群进行分析。结果:与control组相比,ASD-N组的Th17细胞比例增高(p0.05),Treg细胞比例下降(p0.005),IL-17、IL-6和IL-23的水平明显增高(P均0.05)。与ASD-N组相比,ASD-D组的Th17细胞比例下降(p0.05),Treg细胞比例增高(p0.05),IL-17、IL-6和IL-23的水平明显下降(P均0.05)。在肠道菌群的分析中,ASD-N组observed species指数、hannon指数明显低于control组(P均0.01),simpson指数明显高于control组(p0.05),ASD-D组上述指数改变与ASD-N组无显著差异。在细菌门水平上,与control组相比,ASD-N组厚壁菌门明显增多(p0.05),拟杆菌门、变形菌门明显减少(p0.05,p0.01),ASD-D组厚壁菌门明显减少(p0.05),疣微菌门明显增多(p0.05);与ASD-N组相比,ASD-D组厚壁菌门明显减少(p0.05),拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门明显增多(P均0.05)。在细菌纲水平上,与control组相比,ASD-N组拟杆菌纲、δ-变形菌纲明显减少(p0.05,p0.001),ASD-D组疣微菌纲明显增多(p0.05);与ASD-N组相比,ASD-D组拟杆菌纲、δ-变形菌纲、疣微菌纲明显增多(p0.05,p0.01,p0.05),芽孢杆菌纲明显减少(p0.01)。在细菌目水平上,与control组相比,ASD-N组拟杆菌目、脱硫弧菌目明显减少(p0.05,p0.001),ASD-D组疣微菌目明显增多(p0.05);与ASD-N组相比,ASD-D组拟杆菌目、脱硫弧菌目、疣微菌目明显增多(p0.05,p0.01,p0.05),乳酸杆菌目明显减少(p0.01)。在细菌科水平上,与control组相比,ASD-N组脱硫弧菌科明显减少(p0.05),ASD-D组疣微菌科明显增多(p0.05);与ASD-N组相比,ASD-D组乳酸菌科明显减少(p0.01),疣微菌科、脱硫弧菌科明显增多(p0.05,p0.01)。在细菌属水平上,与control组相比,ASD-N组胃球菌属、颤螺旋菌属、CF231和其他菌属明显减少(p0.001,p0.01,p0.01,p0.05),ASD-D组阿克曼菌属明显增多(p0.05);与ASD-N组相比,ASD-D组阿克曼菌属、CF231明显增多(P均0.05),乳酸杆菌属明显减少(p0.01)。在细菌种水平上,与control组相比,ASD-N组罗伊氏乳酸杆菌明显增多(p0.05),ASD-D组罗伊氏乳酸杆菌、其他菌明显减少(p0.001,p0.01);与ASD-N组相比,ASD-D组罗伊氏乳酸杆菌、其他菌明显减少(p0.001,p0.05)。ASD-N组的前额叶GABA水平和5-HT水平明显低于control组(P均0.05),ASD-D组的前额叶GABA水平和5-HT水平明显高于ASD-N组(P均0.05)。ASD-N组的血清GABA水平和5-HT水平明显高于control组(P均0.01),ASD-D组的血清GABA水平和5-HT水平明显低于ASD-N组(P均0.05)。ASD-N组的结肠5-HT水平明显高于control组(p0.01),ASD-D组的结肠5-HT水平明显低于ASD-N组(p0.05)。结论:维生素D在ASD大鼠中可起到Th17/Treg稳态调节作用。维生素D可调节ASD大鼠的肠道菌群失调,Th17/Treg稳态的改善可能参与了这种调节。维生素D可通过上调前额叶5-HT的水平治疗ASD。厚壁菌门相对丰度下降可能参与了外周血5-HT水平的下调。外周血5-HT与前额叶5-HT改变趋势不一致可能与脑肠轴作用有关。维生素D可通过上调前额叶GABA水平治疗ASD,肠道菌群是否影响GABA水平的调节以及如何调节,需要进一步深入研究。


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