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溴结构域抑制剂JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡

闻乃妍  
【摘要】:背景:恶性脑胶质瘤是最常见并且致死率最高的颅内恶性肿瘤,GBM在脑胶质瘤中恶性程度最高。恶性脑胶质瘤的治疗方法包括手术治疗,放疗、化疗等,但是效果并不理想,多数患者的生存期并没有明显的改变,尤其是GBM病人,五年生存率不超过5%,因此亟待找寻更有效地治疗脑胶质瘤的方法。近年来,许多文献报道BRD4蛋白已成为多种癌症的治疗靶点,并且Brd4溴结构域抑制剂JQ1在多种癌症中发挥了良好的抗癌作用。但是针对Brd4和JQ1如何调控恶性脑胶质瘤进程的研究还比较少,作用和分子机制尚不清楚。此外,大部分现有的针对GBM的文献报道主要利用的是脑胶质瘤细胞系如U87、U251等为实验研究对象而不是GSCs。随着对脑胶质瘤的研究不断深入,GSCs越来越被认为是驱动脑胶质瘤发生发展的动力,并且是脑胶质瘤对于治疗药物产生耐药抵抗的元凶。GSCs具有很强的自我更新能力,多向分化潜能和极强的致瘤能力,这使得恶性脑胶质瘤具有高度的异质性。因此,本研究利用GSCs进行实验研究使其结果更具有价值和说服力。目的:选择GSCs作为实验对象,利用JQ1或特异性靶向Brd4的si RNA抑制BRD4蛋白表达及功能发挥,通过体内外实验检测JQ1或si Brd4对GSCs活力、增殖能力、自我更新能力、细胞周期和细胞凋亡的影响,并探讨其发挥作用的机制,初步探讨JQ1与替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)联合用药的作用效果。方法:采用JQ1处理的体外实验分为对照组及不同浓度的JQ1组;采用si Brd4处理的体外实验分为对照组、NC组及si Brd4组(si Brd4-475,si Brd4-1648,si Brd4-3820)。(1)证明Brd4是恶性脑胶质瘤潜在的治疗靶点:利用TCGA数据库分析GBM中Brd4拷贝数;免疫组织化学染色检测各级别人脑胶质瘤组织标本中的BRD4蛋白表达。(2)JQ1或si Brd4对于GSCs细胞活力、细胞增殖、干细胞自我更新能力的作用:利用CCK8实验检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞活力的影响;利用细胞生长计数实验、软琼脂克隆形成实验检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞增殖能力的影响;利用神经球成球能力实验检测JQ1或si Brd4对GSCs自我更新能力的影响。(3)JQ1或si Brd4对于GSCs细胞周期和凋亡的影响:利用PI流式细胞术检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞周期的影响;利用Annexin V-PI流式细胞术和Tunel染色检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞凋亡的影响。(4)JQ1影响GSCs的作用机制及信号通路:采用GO分析(gene set enrichment analysis)和KEGG(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes)明确差异基因的表达以及JQ1对GSCs富集的信号通路;利用q-PCR实验以及Western blotting实验检测信号通路关键基因的m RNA和蛋白表达水平。(5)JQ1对GSCs移植瘤小鼠的治疗作用:BALB/c裸鼠皮下注射1×107个CSC2078细胞,构建GSCs移植瘤小鼠模型。利用JQ1按照50mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射,每日一次,一共进行17天;对小鼠肿瘤组织的体积进行统计分析;对小鼠肿瘤组织切片进行Tunel荧光染色检测凋亡;利用HE染色及免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞形态及各种增殖、侵袭、周期、凋亡等标志物表达;利用Western blotting实验检测PI3K/AKT通路中重要蛋白的表达。(6)JQ1与TMZ联合用药作用:利用Western blotting检测转染si Brd4对CSC2078细胞MGMT m RNA及蛋白表达水平的影响;利用CCK8实验分别检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞活力的影响;利用Compu Syn软件计算JQ1与TMZ联合用药的CI指数;利用PI流式细胞术检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞周期的影响;利用Annexin V-PI流式细胞术检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞凋亡的影响。结果:(1)TCGA数据库分析发现,GBM中的Brd4拷贝数明显高于星形细胞瘤;不同病理级别的人脑胶质瘤组织标本免疫组织化学染色结果显示,在III级和IV级人脑胶质瘤组织标本中普遍存在Brd4高表达的现象。(2)JQ1或si Brd4抑制GSCs活力,细胞增殖和自我更新能力,促进GSCs细胞周期阻滞和凋亡。(3)RNA-Seq结果提示JQ1作用GSCs后,显著抑制PI3K/AKT信号通路上游VEGF表达水平;JQ1与VEGFR2的酪氨酸激酶抑制剂Linifanib联合用药进一步证明JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路对GSCs发挥抗肿瘤作用;JQ1对该信号通路下游周期相关基因的影响:c-Myc,Cyclin D1,RB和E2F1表达降低,P21和P27表达升高;JQ1对该信号通路下游凋亡相关基因中促凋亡基因表达增多,抑制凋亡基因表达减少,DNA损伤标志物γH2AX表达增多。(4)体内实验结果显示JQ1可有效抑制脑胶质瘤干细胞移植瘤小鼠肿瘤体积的增长;JQ1治疗组肿瘤组织中的c-Myc,PCNA,BCL-2以及MMP蛋白表达减少,BAX蛋白表达增多;PI3K/AKT信号通路关键因子蛋白表达与体外细胞实验结果相一致。(5)沉默Brd4表达抑制了MGMT的m RNA和蛋白表达水平;与TMZ单用药组和JQ1单用药组相比,TMZ和JQ1联合用药组对GSCs活力的抑制作用、促进细胞周期阻滞和凋亡作用更为显著。结论:(1)体内外实验证明,抑制Brd4表达或功能可通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进GSCs周期阻滞和凋亡。(2)JQ1通过影响Brd4功能降低MGMT表达水平,进而增强TMZ抗肿瘤作用。(3)Brd4是恶性脑胶质瘤的有效治疗靶点。


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