大豆GmMYB12B2转基因株系的鉴定与分析

【摘要】：大豆[Glycine max(L.)Merr],富含不饱和脂肪酸、蛋白质、大豆皂苷、大豆异黄酮等营养物质,因此又被人们称为“植物肉”,在农业经济中占重要地位。大豆异黄酮属于黄酮类化合物,是大豆发育过程中次生代谢的产物。作为一种植物性雌激素,其具有丰富的营养价值,大豆异黄酮能影响蛋白质的合成、生长因子活性和激素分泌等。研究发现其药理作用丰富,如抗氧化,预防和治疗心血管疾病、更年期综合症、骨质疏松症等,是目前医疗领域研究的潜在抗癌物质。因此选育高异黄酮大豆品种对于医疗健康和经济发展都具有积极意义。研究表明大豆异黄酮的含量除由其合成分解过程中相关酶基因决定外,还受到MYB类转录因子的调控。MYB型转录因子是功能最为多样的一类转录因子,目前已有研究证实MYB转录因子参与了植物中苯丙烷次级代谢途径的调控,黄酮类代谢途径就是其分支之一。研究表明,MYB类转录因子可以正向调控大豆异黄酮的积累,但也有研究证实GmMYB39基因的过表达会抑制大豆异黄酮的合成~([1])。MYB类转录因子的生物学功能广泛,其功能涉及植物生长发育、逆境胁迫以及植物次生代谢等多方面。这些先前的研究成果为GmMYB12B2基因的研究奠定了坚实的基础。本研究在实验室原有的转基因植株基础上运用Elisa、Western blot、Southern blot等分子生物学技术在转录水平和翻译水平上完成了GmMYB12B2转基因株系的鉴定,完成了GmMYB12B2转基因植株的农艺性状调查分析;对GmMYB12B2转基因植株的表达量进行了分析并测定了成熟大豆种子异黄酮的含量。主要实验结果如下:1.Southern blot实验结果表明抗除草剂基因已整合到大豆基因组当中,且是以单拷贝的形式插入;Western blot证实目标蛋白和抗除草剂蛋白都已在大豆中稳定表达;ELISA结果表明,与野生型相比,转基因株系的目标蛋白表达量均达到极显著差异,其中MYB-1和MYB-2达到了非转基因株系的5倍以上,MYB-3达到了非转基因株系的3倍以上。2.qRT-PCR的结果表明,该基因在大豆的根中表达量最高,其次是在胚中表达量较高,在茎叶中的表达量偏低;同一植株中在胚发育前期表达量大致随着胚的成熟而升高,但在30天胚中的表达量有所下降,在40天胚中表达量又再次回升。3.对目标产物的检测分析结果显示,MYB-1和MYB-2转基因植株异黄酮含量与野生型相比有显著提高,分别为4.07mg/g和4.75mg/g,其中MYB-2株系与野生型相比提高了约1.82倍,主要是大豆苷与染料木苷提高较为显著,分别提高了1.77倍和1.90倍。表明在大豆中过表达GmMYB12B2基因,有助于提高大豆异黄酮含量。4.对GmMYB12B2转基因大豆和受体对照大豆材料进行农艺性状对比分析结果表明,MYB-1株系在株高和底荚高度上与对照相比具有显著性差异,MYB-2在株高上与对照相比具有显著性差异,对照与转基因植株其余农艺性状表现均为差异不显著。