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大肠杆菌重组人源DNA-PKcs截短体蛋白的诱导表达和纯化的摸索

邹乐  
【摘要】:DNA-PKcs作为催化亚基与两个调节亚单位Ku70/Ku80异源二聚体组成DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)复合物。该激酶属于磷脂酰肌醇-3激酶相关激酶家族(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases,PIKK),具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶活性,是基因组DNA损伤修复过程中的关键蛋白激酶,几乎参与并决定着非同源末端连接(NHEJ)DNA损伤修复通路的整个进程。其中,作为其催化亚基的DNA-PKcs在DNA双链断裂(DSBs)的修复、端粒及染色体结构的维持、细胞凋亡、抑制肿瘤方面等发挥着非常重要的作用。DNA-PKcs由4128个氨基酸组成。根据结构生物学的研究和分析,DNA-PKcs全长可分为三部分:N端(N-terminal unit,1-892aa)、环形支架区域(Circular Cradle unit,893-2801aa)和头部区域(Head unit,2802-4128aa)。DNA-PKcs的主要功能域分布在Head unit区包括FAT(2908-3539)结构域、PI3K(3645-4029aa)激酶活性结构域和FAT-C结构域。大量的研究表明,DNA-PKcs在DSBs损伤应答过程中对组蛋白H2AX第139位丝氨酸的磷酸化起主导作用。有趣的是,我们课题组最新发表的研究数据提示,DNA-PKcs具有将组蛋白H2A.Z置换入染色质核小体的活性,而且DNA-PKcs对核小体中H2A的磷酸化将有助于其置换活性。但是,从DNA-PKcs的序列检索中并没有发现和染色质重塑酶相关功能域结构,参与这一置换功能的区域尚待进一步研究和明确。因此,深入研究和明确DNA-PKcs的这一置换活性及其机制对阐明DNA-PKcs这一新的活性及其在细胞内的生物学功能有着重要的理论意义。鉴于DNA-PKcs是一个含有4128个氨基酸的大分子,为了便于体外实验和弄清其能够发挥置换组蛋白变体H2A.Z的功能区域,在本研究中,首先将全长DNA-PKcs设计为八个小段区域,即PI3K(3747-4128 aa)、FAT(2908-3539 aa)、1-412 aa、500-1025 aa、1000-1525 aa、1500-2000 aa、1878-2182 aa、2261-2700 aa。然后,通过PCR构建了表达GST融合蛋白的pGEX-6p-1-DNA-PKcs-truncate的质粒;其次,借助体外E.coli表达系统,分别优化了不同截短体蛋白的诱导表达条件,并利用GST-pulldown技术纯化DNA-PKcs的不同截短体蛋白,并结合考马斯亮蓝和免疫印迹实验证实截短体蛋白的表达;最后,利用分离柱(孔径小于3000MWCO)分别浓缩纯化的DNA-PKcs不同截短体蛋白,蛋白定量后利用体外激酶活性检测体系,以组蛋白H2AX作为底物,第139位磷酸化的特异抗体来判断重组体蛋白催化活性的有无。本研究的宗旨在于通过表达DNA-PKcs不同截短体蛋白,明确DNA-PKcs中与其H2A.Z置换入染色质中活性相关的功能域部位,并阐明DNA-PKcs的激酶活性与其置换组蛋白变体H2A.Z的相互作用机制提供理论依据和实验基础。


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