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骨髓间充质干细胞对光感受器细胞自噬与溶酶体功能影响的研究

李莹  
【摘要】:研究背景:饥饿或压力应激状态下,细胞自噬启动,包裹代谢废物及损伤细胞器形成自噬体并最终进入溶酶体代谢。该过程有效、稳定运行对细胞稳态的维持至关重要。已有研究表明,溶酶体功能障碍与神经系统疾病密切相关,多种神经系统疾病的病理过程中均伴有溶酶体相关功能异常,而溶酶体功能障碍或基因突变导致的代谢异常类疾病亦会引起严重的神经功能障碍。作为视觉传导的初级神经元,多种病理条件下视网膜光感受器细胞功能受损或细胞死亡将引起不同程度视力障碍。目前对其死亡机制的研究尚集中于氧化应激,内质网应激,线粒体损伤,细胞凋亡等领域。随着近年来,溶酶体功能研究的逐步深入,其功能状态与光感受器细胞的相关联系日益增多。疾病过程中细胞自噬及溶酶体代谢的异常虽已引起学者注意,却多止步于自噬现象的发现,缺少针对自噬-溶酶体代谢过程的探讨。mTOR是参与调节细胞代谢、合成、增殖、死亡等过程的关键信号因子。近年来的研究表明,mTOR可定位于溶酶体,并对自噬起始、溶酶体生物合成、溶酶体再生等过程均有重要调节作用。此外,mTOR在视网膜退行病变,如视网膜色素变性及年龄相关黄斑变性疾病中,促进光感受器细胞的存活作用亦被多个研究证实。目前的研究认为,mTOR通过促进细胞能量代谢、生物合成及抗凋亡作用促进压力应激下的光感受器细胞存活。但此过程中,是否涉及细胞自噬及溶酶体功能的调节作用尚不得而知。骨髓间充质干细胞,具有多向分化潜能,其在损伤细胞、组织修复方面的作用使其成为细胞疗法研究的热点。在视网膜疾病领域,干细胞对于视网膜神经节细胞、光感受器细胞、视网膜色素上皮的保护作用已经得到证实。目前认为,干细胞主要通过旁分泌、细胞分化替代影响病损组织细胞修复。在中枢神经系统疾病的相关干细胞研究中,有报道指出干细胞可促进神经元内溶酶体代谢,减轻神经元内溶酶体沉积改善细胞表型异常。这种机制是否存在于干细胞对损伤的光感受器细胞的保护作用中尚待证实。本研究旨在明确光感受器细胞损伤过程中,应激状态的光感受器细胞是否存在自噬-溶酶体代谢异常;骨髓间充质干细胞是否能够通过调节溶酶体代谢过程保护压力状态下的光感受器细胞。目的:应用MNU诱导661w细胞损伤建立光感受器细胞损伤体外实验模型,评价细胞损伤过程中细胞自噬起始、自噬过程及溶酶体代谢情况;通过BMSCs与661w细胞共培养,观察干细胞对661w细胞的保护作用,并明确其对细胞自噬及溶酶体功能的影响。方法:1、MNU诱导661w细胞损伤模型建立与评价应用MNU浓度为100、300、500、1000ug/ml的培养基培养661w细胞,MTS法检测培养不同时间细胞活力变化,以确定后续实验所需作用浓度;应用500ug/ml MNU培养基培养661w细胞,观察随MNU作用时间延长细胞形态变化、DCFH-DA探针标记活性氧激活情况、western blot(WB)检测细胞凋亡蛋白caspase3表达水平,以评价MNU作用对细胞形态、氧化应激及细胞凋亡的影响。2、观察661w细胞损伤过程中细胞自噬及溶酶体代谢情况为明确MNU诱导细胞损伤过程中细胞自噬的情况,应用MNU500ug/ml的培养基培养细胞,分别于作用不同时间,电镜下观察细胞内自噬样囊泡形态,WB检测自噬相关蛋白LC3、P62表达情况;为评定该过程中是否存在自噬流受阻,应用溶酶体抑制剂bafilomycin A1与MNU共同作用24小时,WB检测LC3、P62表达情况;为明确抑制自噬对细胞的影响,应用自噬抑制剂3MA与MNU共同作用24小时,MTS法检测自噬抑制对损伤细胞细胞活力的影响,WB法检测抑制自噬对LC3、casepase3表达的影响;为观察损伤细胞溶酶体及溶酶体内酶分布情况,MNU作用24小时,应用lysosome tracker、cathepsin标记细胞溶酶体及其内的蛋白酶;并用WB法检测mTOR磷酸化水平以确定细胞损伤过程中是否存在mTOR活性抑制。3、在transwell共培养体系中评价干细胞对光感受器细胞保护作用于大鼠股、胫骨骨髓中分离、提取BMSCs原代培养,并行流式细胞仪干细胞表面标记物:CD105、CD90、CD44、CD34、CD45鉴定;通过transwell小室内接种BMSCs建立损伤的661w细胞、BMSCs共培养体系,实验分为正常组、MNU组及共培养组。同样方法检测MNU处理24小时,661w细胞活力、活性氧激活情况,并检测MNU处理16、24小时caspase3蛋白表达情况,明确干细胞对损伤细胞的影响。4、观察干细胞对661w细胞自噬和溶酶体功能的影响MNU处理16或24小时,同样方法检测细胞内自噬样囊泡形态、LC3和P62表达情况,溶酶体及溶酶体酶细胞内分布,mTOR激活情况,以评价干细胞对细胞损伤过程中细胞自噬及溶酶体代谢的影响。结果:1、100、300ug/ml MNU对661w细胞活力影响有限;500、1000ug/ml MNU明显降低细胞活力,呈时间依赖趋势;选取500ug/ml作为后续实验浓度。随培养时间延长,细胞内致密颗粒增多,细胞融合度降低;细胞内活性氧探针荧光增强;凋亡蛋白caspase3活性形式表达增加;2、MNU处理24小时,细胞内自噬样囊泡数量、直径、面积增加;MNU作用过程中,自噬相关蛋白LC3II、LC3II/I水平增加,同时伴有自噬底物标记物P62累积;MNU处理同时添加溶酶体抑制剂bafilomycin A1抑制自噬体与溶酶体融合,LC3II、LC3II/I水平上升,P62累积增加;MNU处理同时添加3MA自噬抑制剂可抑制细胞自噬-降低细胞LC3II、LC3II/I蛋白表达水平,亦减低细胞活性,并可促进细胞活性形式caspase3的表达;MNU处理24小时,相比于正常细胞散在分布的荧光信号,溶酶体探针荧光聚集状、趋向细胞核周分布,溶酶体组织蛋白酶染色荧光信号斑点状分布;细胞内磷酸化mTOR水平在MNU处理16-24小时明显下降;3、骨髓间充质干细胞原代提取、分离培养,传至第三代形态稳定,流式细胞仪干细胞表面标记物鉴定CD105、CD90、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性;MNU作用同时给与干细胞共培养,观察干细胞对损伤细胞的影响;相比于MNU组,共培养组细胞活性明显上升、活性氧标记探针荧光减弱;活性形式caspase3表达减低;4、观察干细胞对损伤细胞自噬及溶酶体代谢的影响:相比于MNU组,共培养组细胞内自噬样囊泡数量减少、直径、面积减小;MNU作用16小时,共培养组LC3II、LC3II/I水平与MNU组无显著差异,P62累积减少;MNU作用24小时,共培养组LC3II水平较MNU组明显减低,P62累积减少;MNU作用24小时,共培养组细胞内,溶酶体荧光探针及溶酶体酶荧光信号趋向分散分布;MNU作用16小时,共培养组磷酸化mTOR水平较MNU组增加。结论:1、MNU可诱导661w细胞损伤,过程中伴随细胞活性下降,活性氧激活及凋亡增加等病理过程符合视网膜病变过程中光感受器细胞损伤机制。故此模型可用于针对光感受器细胞损伤机制的体外研究;2、MNU诱导661w细胞损伤过程中,持续的自噬激活造成自噬样囊泡增大、代谢底物累积、溶酶体代谢障碍;而抑制该过程中的细胞自噬后,加重细胞损伤。即细胞应激状态下,由持续的细胞自噬收集转运的代谢底物不能完全被溶酶体降解,最终导致细胞死亡;此过程中伴随mTOR活性抑制;3、骨髓间充质干细胞可在提升细胞活力、减弱活性氧激活及减少细胞凋亡方面保护受损的661w细胞;4、骨髓间充质干细胞可减少细胞内自噬样囊泡的直径和面积,减少代谢底物累积、促进溶酶体在细胞内再分布,即干细胞促进损伤细胞溶酶体内底物代谢。此过程中伴随mTOR活性上调。综上,光感受器细胞损伤过程中伴有持续性自噬激活引起的溶酶体代谢障碍,骨髓间充质干细胞可以促进溶酶体代谢,减少细胞死亡。上述过程的发生伴随mTOR活性变化。


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