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长链非编码RNA Oslr9对干细胞多能性的调控作用及其机制的研究

朱颜铂  
【摘要】:背景:终末分化的体细胞可以通过核移植、细胞融合、转录因子的转导等方法重编程为类胚胎干细胞的多能干细胞状态,使其具有无限自我更新及分化成所有细胞类型的能力,我们将这一过程称为体细胞重编程(somatic cell reprogramming,SCR)。该技术的产生为再生医学、疾病个体化治疗及药物筛选等提供了巨大的前景。然而无论使用何种方法的体细胞重编程均具有非常低的效率,因此限制了其在医学等方面的应用潜能。目前,多能干细胞自我更新和多能性的维持以及重编程过程的机制尚未明确,但是这对于维持干细胞多能性以及提高重编程效率是至关重要的。研究表明多能性状态的维持或向任何胚层分化取决于数千个基因表达的因子通过表观遗传学、转录中及转录后的调控。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类不具有编码蛋白质功能但却参与到很多生物学过程的RNA,如今有越来越多的证据表明其通过基因印记、染色质重塑等方面调控基因的表达,并且被发现参与到调控干细胞多能性的维持与细胞分化中。目前有很多专家学者致力于研究lnc RNA在干细胞多能性中的表观遗传学修饰作用,从而找到改进细胞重编程效率的方法。在本实验室的前期研究中,我们使用染色质-RNA原位逆转录测序(chromatin-RNA in situ reverse transcription sequencing,CRIST-seq)技术,捕捉与多能性基因Oct4、Sox2启动子相结合的lnc RNA。通过结合分析CRIST-seq和RNA-seq的结果,发现了一条与Oct4、Sox2启动子结合的长链非编码RNA,并将其命名为Oct4-Sox2 promoter binding lnc RNA 9,简称Oslr9。我们推测Oslr9与干细胞多能性密切相关,并对其展开了多方面的深入研究。目的:本研究旨在明确lnc RNA Oslr9的差异性表达、全长序列和亚细胞定位等基本信息,并探索其对干细胞多能性的调控作用及其发挥作用的表观遗传学调控机制。方法:1.联合使用染色质-RNA原位逆转录测序(CRIST-seq)和RNA测序(RNA-seq)的结果揭示与干细胞多能性密切相关的lnc RNA Oslr9。2.采用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)来确定Oslr9的全长序列信息。3.通过实时定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)测定Oslr9及3种干细胞多能性核心因子(Oct4、Sox2、Nanog)在细胞重编程各个阶段、胚胎干细胞分化过程中的表达水平。4.通过RNA荧光原位杂交技术及胞核胞浆分离实验确定Oslr9的亚细胞定位。5.在小鼠诱导多能干细胞(mi PSC)中敲低表达Oslr9,检测其对细胞功能的影响:构建两个含有短发夹RNA结构的质粒并稳定转染到mi PSC中,用实时定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)测定Oslr9及Oct4、Sox2、Nanog在mi PSC组、mi PSC+p Green vector组和mi PSC+sh Oslr9组的表达情况;采用MTT法分别测定mi PSC组、mi PSC+p Green vector组和mi PSC+sh Oslr9组细胞增殖能力;用细胞免疫荧光染色评定下调Oslr9后对细胞的多能性状态的影响。6.Oslr9激活干细胞多能性因子的作用:构建Oslr9过表达质粒,并将其稳定转染到小鼠成纤维细胞中,用RT-q PCR测定在m FIB、m FIB+Ds Red vector组和m FIB+Oslr9组中Oslr9及Oct4、Sox2、Nanog的表达情况;采用双荧光素酶报告基因检测系统(dual-luciferase reporter assay system)明确Oslr9对于多能性基因启动子的激活情况。7.通过RNA逆转录相关捕获实验(RNA reverse transcription-associated trap,RAT)来揭示Oslr9与DNA的结合情况。8.采用亚硫酸氢盐测序法来判定Oct4基因处启动子和增强子元件甲基化状态。9.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术检测Tet蛋白与Oct4基因调控元件之间的相互作用。10.采用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)技术明确Oslr9与Tet蛋白的结合情况。11.采用染色质空间构想捕获(chromatin conformation capture,3C)技术来研究Oslr9对Oct4基因增强子-启动子三维空间环状结构的调控作用。结果:1.通过CRIST-seq和RNA-seq结果分析,筛选出多能性相关长链非编码RNA Oslr9。RNA-seq提示Oslr9在小鼠诱导多能干细胞(mi PSC)中高表达而在小鼠成纤维细胞(m FIB)中低表达;CRIST-seq提示Oslr9与多能性基因Oct4和Sox2启动子处结合。3’-和5’-RACE显示Oslr9存在两个转录变体,其中一个与Gm28268具有相同的序列,另外一个具有两个外显子且5’末端与Gm28268不同,长度为914 bp。2.Oslr9在小鼠诱导多能干细胞(mi PSC)和小鼠胚胎干细胞(m E14)中高表达,而在小鼠成纤维细胞(m FIB)和未成功重编程为i PSC的细胞(m URC)中表达沉默;在拟胚体形成过程中Oslr9表达情况与Oct4、Sox2和Nanog一致,均呈现出逐渐下调趋势。3.胞核胞浆分离实验及RNA-FISH表明Oslr9主要位于细胞核内。4.在mi PSC中敲低表达Oslr9后,与转入了p Green vector及mi PSC组比较,其多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达下调,且增殖能力降低;形态学上显示下调Oslr9表达后的mi PSC细胞增大,呈现出扁平且细长的形态,免疫荧光染色表明其多能性因子Oct4和Nanog的表达降低。5.在小鼠成纤维细胞中过表达Oslr9后,多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达上调;双荧光素酶报告实验显示转入了Oslr9过表达质粒的细胞与对照组相比,Oct4、Sox2和Nanog基因的启动子被明显激活。6.甲基化检测结果表明,与对照组相比,转入了Oslr9过表达质粒的成纤维细胞中Oct4基因启动子和5’近端增强子处发生明显去甲基化;染色质免疫共沉淀提示Oslr9可以介导Tet1蛋白与Oct4基因调控元件的结合;RNA免疫共沉淀及测序结果显示Oslr9通过第1外显子与Tet1蛋白结合。7.染色质-RNA原位逆转录测序(CRIST-seq)结果表明Oslr9的第1外显子与Oct4启动子结合,Oslr9的多个外显子均与Sox2启动子有结合;RNA逆转录相关捕获实验证实Oslr9与Oct4基因的启动子、增强子及外显子均有结合。染色质空间构象捕获(3C)实验表明Oslr9参与到Oct4基因启动子和增强子多个环状结构的形成中,拉近了启动子与增强子的距离,从而促进了多能性基因Oct4的表达。结论:1.Oslr9为X染色体上的结合于Oct4-Sox2基因启动子的基因间长链非编码RNA,其存在两个转录变体。2.Oslr9主要在细胞核内发挥作用,在mi PSC和m ESC中高表达,在m FIB和m URC中几乎不表达,其表达水平与多能性基因成正相关。3.Oslr9与干细胞多能性和重编程密切相关,具有维持干细胞多能性及促进多能性基因表达的作用。4.Oslr9通过第1外显子招募Tet1蛋白,诱导Oct4启动子和5’近端增强子去甲基化,激活Oct4的启动子和5’近端增强子,从而促进多能性基因Oct4的表达。5.Oslr9可以参与介导形成Oct4基因处的5’增强子-启动子和3’增强子-启动子的四个染色质内环空间三维结构,拉近增强子与启动子的距离,促进Oct4基因的表达。


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