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基于mnd2小鼠骨骼肌NRF-1/NRF-2的差异表达探讨核-线粒体失衡在肌少症发病中的作用

周昊函  
【摘要】:研究背景:衰老过程中,骨骼肌退行性改变是机体最为显著的变化之一,表现为骨骼肌质量、力量和运动功能的进行性下降,最终发展为肌少症(sarcopenia)。骨骼肌蛋白合成与分解失衡、肌细胞凋亡及线粒体功能紊乱等与肌少症发生发展相关。由于线粒体在肌细胞内能量供应、氧化还原稳态中的关键作用,线粒体功能紊乱被认为是肌少症发病的核心机制。线粒体生物合成障碍导致氧化磷酸化异常,是线粒体功能紊乱的主要原因。线粒体是双基因组细胞器,呼吸链由核与线粒体DNA共同编码。目前认为,氧化磷酸化等线粒体功能以及线粒体分裂与融合等结构变化都需要核与线粒体基因组的协同来维持。氧化磷酸化相关基因等线粒体生物合成靶标的表达与活性是核-线粒体对话(mitonuclear crosstalk)功能是否正常的具体表现。因此,从核-线粒体对话角度探讨骨骼肌退变的机制,有助于阐明线粒体功能紊乱在肌少症发病中的作用。呼吸链亚基的表达主要是由线粒体生物合成因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅助激活因子1α(peroxisome proliferatoractivated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)及其下游的核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF-1)、核呼吸因子2(nuclear respiratory factor 2,NRF-2)进行调控的。线粒体生物合成因子在核-线粒体交叉对话机制中也发挥着重要的作用。但是关于这些因子在骨骼肌核-线粒体失衡中发挥的作用及机制尚缺乏报道。高温需求因子2(High temperature requirement factor A2,HtrA2/Omi)是一类核编码线粒体丝氨酸蛋白酶。以往人们主要关注了该蛋白酶在凋亡过程中的作用,发现在凋亡因素等刺激下,HtrA2/Omi可以被释放至细胞浆,通过caspase信号途径参与凋亡信号转导。最近研究发现,HtrA2/Omi还可以通过其丝氨酸酶活性参与未折叠蛋白,错误蛋白或者过剩蛋白的降解,促进线粒体蛋白稳态的维持,并参与了线粒体生物合成,线粒体形态、氧化还原平衡等多种进程的信号转导,提示HtrA2/Omi在核-线粒体对话机制中可能扮演了重要角色。HtrA2/Omi蛋白276位丝氨酸错义突变的运动神经元退变2(motor neuron degeneration 2,mnd2)小鼠表现为神经退变,运动异常,肌萎缩以及早衰性死亡,提示HtrA2/Omi蛋白酶活性在衰老相关疾病中的保护性作用,以HtrA2/Omi为切入点,有助于探讨核-线粒体对话机制在骨骼肌退变中的作用。随着研究的深入,核-线粒体对话相关功能与信号转导越来越复杂,生物大数据为相关的研究提供了方便,通过与传统的实验室手段有机结合,将会为进一步研究核-线粒体对话机制在线粒体功能紊乱中的作用提供可能。因此本研究利用HtrA2/Omi蛋白酶活性缺失的mnd2小鼠,结合机能学、形态学、生物信息学分析和基因表达的验证等,进一步阐明核-线粒体对话调控线粒体功能的机制,及其在骨骼肌退变和肌少症中的作用。研究方法:1、本研究利用mnd2小鼠探究骨骼肌中HtrA2/Omi蛋白酶活性的作用,借助在体骨骼肌收缩力测试,抓力测试,悬挂试验等运动机能学实验方法评价mnd2小鼠骨骼肌肌力和运动表型。2、应用HE染色,天狼猩红染色等形态学实验技术和高通量形态学定量分析手段,评价骨骼肌退变表型。3、应用qPCR,western blot和免疫组织染色,线粒体代谢产物水平和呼吸酶活性检测等功能表征实验技术,评价线粒体功能,电子传递链复合体亚基的表达,以及线粒体生物合成的活化情况。4、为明确HtrA2/Omi在骨骼肌退变中的作用方式,研究利用肌少症表达芯片进行基因数据的生物信息学分析,通过非基于先验假设的方式探究HtrA2/Omi在肌少症中的生物学功能,以及肌少症中与HtrA2/Omi表达有相关性的基因。研究结果:1、纯合子小鼠体重,腓肠肌重量,骨骼肌体重指数(skeletal muscle mass index,SMI)及生理横截面积均显著低于野生型和杂合子小鼠。在抓力测试和在体腓肠肌特异性收缩力测试中,纯合子小鼠的单程收缩力和强直收缩力均显著降低,经生理性肌横截面积校正后,显著性依然保持。运动表型实验结果显示,纯合子小鼠悬挂时间明显缩短,悬尾静止时间明显延长。形态学实验结果显示,纯合子小鼠腓肠肌横截面HE染色可见破碎或分段的肌纤维,嗜酸性的均匀胶状染色的玻璃样变性,以及纤维间质脂肪填充,部分肌纤维可见细胞核中心化现象,以及明显的多核化现象。天狼猩红染色显示纯合子小鼠腓肠肌肌纤维间质增宽,胶原纤维沉积。单个肌纤维高通量形态学定量分析结果表明,纯合子小鼠腓肠肌肌纤维的平均横截面积下降,不规则程度增加。肌纤维分型标志基因的qPCR结果显示,纯合子小鼠腓肠肌组织中Myh1,2,4,7基因的mRNA表达水平均显著降低。失神经支配敏感基因的qPCR结果显示,纯合子小鼠腓肠肌组织中MyoD和Myogenin的mRNA表达水平无显著变化,AChRα和AChRγ则显著降低。2、纯合子小鼠腓肠肌组织中,线粒体标志蛋白VDAC1的蛋白表达水平显著降低。VDAC1免疫组织染色结果表明,纯合子小鼠腓肠肌丧失高度规则排列的线粒体分布特征,并出现斑块状线粒体缺失区域。与VDAC1结果相一致的是,线粒体基因(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数在纯合子小鼠中显著下降。ATP、ROS生成水平和线粒体电子传递链复合体I活性,在纯合子小鼠腓肠肌组织中均显著下降。3、肌少症表达芯片数据的基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)结果显示,多个线粒体呼吸功能相关的生物学进程或细胞组分与Omi表达高度相关,如氧化磷酸化,有氧呼吸,线粒体电子传递链等。提示Omi与线粒体呼吸功能具有高度的相关性。研究纳入了“氧化磷酸化”基因集用于后续分析。该基因集涵盖了呼吸链的全部85个核心亚基,以及若干呼吸链伴侣亚基。表达相关性分析结果显示,骨骼肌中HtrA2/Omi与多数核编码呼吸链亚基表达负相关(γ-0.7),与线粒体编码呼吸链亚基表达正相关(γ0.7)或无相关性,这表明核与线粒体编码亚基对Omi的反应性存在差异。研究进而在mnd2小鼠中对上述结果进行实验验证,结果显示,相比于野生型,在纯合子小鼠腓肠肌组织中,大部分nDNA编码亚基的mRNA表达水平显著下调,而NDUFS7,NDUFV2,SDHC,SDHD,COX6A1和COX8A则无显著性改变,仅SDHA和UQCRB和UQCRFS1表现为明显上调。相反,mtDNA编码亚基则表现为无显著性改变或明显上调。4、肌少症表达芯片数据分析显示,线粒体生物合成基因与HtrA2/Omi的相关性呈现明显的聚类现象,其中NRF-1和NRF-2分属两个类别,与HtrA2/Omi的相关性呈现相反的趋势,与此相一致的是,前述结果中与HtrA2/Omi的表达呈现负相关性的呼吸链亚基(如nDNA编码的NDUFA1,NDUFB4,NDUFS1,NDUFV1,UQCRH,CYCS,COX5A,COX6C,ATP5A1,ATP5B等)均是NRF-1靶基因;而与HtrA2/Omi呈现正相关性或无相关性的呼吸链亚基(如nDNA编码的COX6A1,COX8A,SDHD和UQCRFS1,以及mtDNA编码亚基)均是NRF-2靶基因。实验验证结果显示:Western blot、qPCR和免疫组织染色等实验中,mnd2小鼠腓肠肌的NRF-1与NRF-2的表达呈现相反趋势,提示纯合子小鼠骨骼肌中NRF-1与NRF-2呈现差异性表达。在纯合子小鼠腓肠肌内,低表达的核编码呼吸链亚基,主要是NRF-1的转录靶基因,而高表达的核编码亚基以及线粒体编码亚基,则均为NRF-2的转录靶基因。纯合子小鼠腓肠肌组织中PGC-1α的蛋白和mRNA表达下降,其靶基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1和2,解偶联蛋白2(catalase and uncoupling protein 2,UCP2),谷胱甘肽过氧化物酶1(Glutathione peroxidase 1,GPX1)等的表达均下调。5、本研究对肌少症表达芯片数据共进行了15种对比分析,其中8种对比的差异基因包含Omi。最终选取12月龄组与27月龄组的对比方式进行深入分析。共获得2703个差异表达基因。进一步筛选关键的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),找到12个关键基因与HtrA2/Omi的表达具有相关性。构建以HtrA2/Omi为核心的蛋白互作调控网络,结果显示12个关键基因中8个与HtrA2/Omi存在蛋白互作关系,其中的Akt1已被研究证实在骨骼肌中能够翻译后修饰PGC-1α。对其进一步分析显示,Akt1与PGC-1α,NRF-1及其呼吸链靶基因存在强负相关性,而与NRF-2及其呼吸链靶基因(部分nDNA编码的和全部mtDNA编码的呼吸链亚基)存在强正相关性或无相关性。qPCR和免疫组织化学实验结果显示:与野生型相比,纯合子小鼠腓肠肌组织中Akt1的mRNA表达水平显著上调。研究结论:1、mnd2小鼠肌量,肌力和运动功能均显著下降。肌肉组织形态改变符合骨骼肌退变的病理学表现。机能学、组织形态学、单个肌纤维高通量分析以及基因表达检测结果都提示,mnd2小鼠发生了肌少症。2、mnd2小鼠腓肠肌组织中线粒体数量明显下降,分布异常,氧化磷酸化功能降低,表明HtrA2/Omi酶活性缺失导致小鼠骨骼肌中线粒体功能减退。提示线粒体功能异常可能是导致mnd2小鼠发生肌少症的重要原因。3、通过结合生物信息学分析和实验验证,明确了mnd2小鼠骨骼肌中核-线粒体失衡的发生,观察到PGC-1α下游NRF-1/NRF-2的差异表达与核-线粒体失衡的相关性。表明NRF-1/NRF-2所致的核-线粒体失衡可能是导致线粒体功能减退的机制之一。4、通过结合生物信息学分析和实验验证,初步探明HtrA2/Omi酶活性可能通过影响Akt1基因的表达干预线粒体生物合成,提示HtrA2/Omi-Akt1-PGC1α通路可能是mnd2小鼠中核-线粒体失衡导致线粒体功能减退和骨骼肌退变的机制之一。因此HtrA2/Omi-Akt1-PGC1α通路可能成为骨骼肌退变预防和治疗的药物靶点。


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