收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

PPARγ启动子突变在股骨头坏死BMSCs成脂成骨转分化中的作用及其分子机制研究

李照彦  
【摘要】:背景:股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由遗传易感因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病,病变骨髓腔往往充填了大量脂肪组织,因而脂代谢紊乱早已被公认为ONFH核心发病环节。随着ONFH发病率的逐年增加及对人类健康威胁的日益突出,ONFH的分子发病机制愈来愈成为骨科领域关注的热点。鉴于动物实验及临床研究已充分证实,高脂环境可以抑制成骨细胞的分化,高脂血症后骨髓内脂肪细胞增多增大压迫股骨头微血管引起骨细胞缺血性坏死,较早就推测成脂与成骨的转分化异常可能在ONFH发生发展中起关键作用,但一直不清楚脂肪蓄积的分子机理。近年对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化微环境的研究,惹人注目地发现了关键转录因子PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ)在调节成脂、成骨分化中的关键作用。作为成脂分化的主调控器,PPARγ在脂肪细胞、BMSCs分化序贯的分子级联事件中,被广泛应用作为成脂分化的标志。本项目团队最近应用质谱技术对ONFH病例对照体系的研究率先发现,PPARγ基因启动子rs2920502突变(CC型)与中国汉族人群ONFH发病风险显著相关,且同步分析发现ONFH患者血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)含量及LDL-c/HDL-c比值显著升高,高密度脂蛋白(HDL-c)含量显著减低,尤为重要的是这个启动子突变CC基因型显著相关于ONFH患者血清TG水平,首先证实了作为脂肪形成主调节器的PPARγ基因启动子突变显著相关于ONFH发病风险及其脂代谢紊乱。ONFH分子机理研究的标志性进展是确认了多个易感基因相关于ONFH风险,但由于缺乏突变基因的功能验证,难以确认其在ONFH发生中的作用。鉴于PPARγ对成骨与成脂分化的独特调节作用,以及项目团队的PPARγ基因启动子突变介入ONFH发病风险的新发现,PPARγ很可能在启动及加重ONFH病变股骨头脂肪蓄积的分子事件中起关键作用。为进一步阐述PPARγ启动子突变在ONFH发生中的分子机理,本研究建立了ONFH病例对照体系,体外分离与培养入组病例BMSCs,进行PPARγ启动子rs2920502位点基因分型,系统研究不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs成脂成骨转分化作用的影响;不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs PPARγ转录与翻译水平表达的影响;PPARγ启动子突变对BMSCs成脂成骨转分化作用涉及的关键分子标志物的影响及PPARγ基因启动子突变对其活性影响的荧光素酶报告基因验证。解析PPARγ启动子突变与ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及潜在分子靶点,促进分子病因学研究与ONFH的临床防治及早对接。研究方法:1.采集关节外科54例ONFH手术患者骨髓血10ml,32例股骨颈骨折手术患者骨髓血10ml,采用梯度离心法分离BMSCs,应用低糖DMEM培养基贴壁培养BMSCs。应用相差显微镜观察细胞形态学及生长情况。2.应用流式细胞仪对BMSCs进行细胞表面抗原及细胞周期检测,CCK-8方法检测细胞增殖能力。3.应用Sanger测序法对54例ONFH组和32例对照组BMSCs进行PPARγ启动子rs2920502位点的基因分型。4.应用成脂、成骨分化诱导试剂盒诱导培养的BMSCs向成脂成骨分化。应用茜素红染色、油红O染色及定量萃取的方法对BMSCs成脂成骨分化能力进行分析。5.应用qRT-PCR、Western blot方法检测PPARγ及成脂成骨关键基因在BMSCs成脂成骨过程中的表达。6.应用PCR技术分别从具有rs2920502 GG型与CC型的BMSCs细胞DNA基因组克隆PPARγ基因启动子片段,将获取的启动子片段重组入荧光素酶报告基因慢病毒表达载体,构建成能够检测具有rs2920502不同分型的启动子在细胞内调控基因表达活性的慢病毒载体。7.应用293FT细胞完成了慢病毒的包装与制备,应用流式细胞仪计算慢病毒滴度。将包装慢病毒感染BMSCs细胞,通过荧光显微镜观察病毒感染情况。8.通过双荧光素酶活性检测评估不同PPARγ启动子rs2920502基因型的启动子活性。实验结果:1.成功分离培养了来自54例ONFH患者和32例股骨颈骨折手术患者股骨干近端骨髓血的BMSCs,培养的BMSCs符合间充质干细胞形态学特征,细胞表面CD73、CD90及CD105抗原表达阳性,CD34和CD45抗原表达阴性。ONFH与对照组患者分离培养的BMSCs细胞周期无显著统计学差异,ONFH组BMSCs增殖能力略低于对照组,但两组间无显著统计学差异。2.油红O与茜素红染色及其定量分析显示,ONFH BMSCs成脂分化能力显著强于对照组(P0.05),ONFH组BMSCs成骨能力显著弱于对照组(P0.05);qRT-PCR检测BMSCs成脂成骨分化相关基因表达结果,ONFH组BMSCs成脂相关标志物PPARγ、维甲酸受体α(RXRα)、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα)、脂蛋白脂酶(LPL)及脂肪酶(Adipsin)表达量显著高于对照组(P0.05)。ONFH组BMSCs成骨相关标志物果蝇同属Runt相关转录因子2(RUNX2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨桥蛋白(OPN)、锌指结构转录因子(Osterix)的表达量显著低于对照组(P0.05),阐述了ONFH BMSCs成脂成骨转分化障碍的特点及其关键分子靶点。3.首次完成了ONFH病例对照体系BMSCs PPARγ启动子rs2920502的基因分型,ONFH组BMSCs rs2920502分型分布为GG型32例,GC型19例,CC 3例,对照组rs2920502分型分布GG型16例,GC型15例,CC型1例。基因分型的结果与本项目组前期在361例ONFH病例对照体系外周血单个核细胞(PBMC)基因组分型结果的分布趋势一致,为进一步阐述PPARγ启动子突变对成脂成骨转分化的影响奠定了关键基础。4.不同基因分型BMSCs成脂成骨分化能力结果显示,ONFH组和对照组BMSCs PPARγ启动子rs2920502 CC型成脂能力显著高于GG型(P0.05),而成骨能力显著低于GG型(P0.05),率先阐述了PPARγ启动子突变影响BMSCs成脂成骨分化能力的科学证据。5.PPARγ启动子突变对其基因表达影响的研究结果发现,BMSCs在成脂诱导后第7天,两组BMSCs CC型PPARγ表达量均显著高于GG型和GC型(P0.05);在成脂诱导后第14天,ONFH组CC型PPARγ表达量显著高于GG型和GC型,对照组CC型PPARγ表达量也显著高于GG型(P0.05)。ONFH组和对照组之间BMSCs不同基因分型的PPARγ表达量分析发现,在成脂第7天,ONFH组GC型和CC型PPARγ表达量均显著高于对照组GC型和CC型,在成脂第14天,ONFH组GG型、GC型及CC型PPARγ表达量均显著高于对照组GG型、GC型及CC型(P0.05),率先提出了PPARγ启动子突变影响其基因表达的实验证据。6.PPARγ启动子突变相关的关键分子标志物研究结果发现,成脂诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成脂标志物RXRα、CEBPα、LPL表达量显著高于GG型(P0.05)。在成骨诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成骨标志物RUNX2表达量显著低于GG型(P0.05),ONFH组BMSCs CC型成骨标志物Osterix表达量亦显著低于GG型(P0.05)。而且,成脂诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型RXRα、CEBPα、LPL及Adipsin表达量均显著高于对照组GG型、GC型及CC型(P0.05)。成骨诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型成骨标志物RUNX2、BMP2、OPN、ALP及Osterix表达量均显著低于对照组GG型、GC型及CC型(P0.05),率先阐述了PPARγ启动子突变引起ONFH BMSCs成脂成骨转分化异常的关键分子靶点。7.成功构建了PPARγ启动子rs2920502慢病毒表达载体LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC,通过酶切、基因测序鉴定证实序列及插入方向正确,并实现了慢病毒载体在293FT细胞的成功包装,慢病毒滴度为3.49 x10~8 TU/mL。荧光素酶活性检测结果显示,慢病毒载体感染BMSCs在转染72h后,转染LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC慢病毒颗粒的细胞荧光素酶活性无明显差异。在成脂诱导第7天、第10天及第14天,LV-pPPARγ-CC荧光素酶活性明显高于转染LV-pPPARγ-GG慢病毒载体组,率先阐述了PPARγ启动子rs2920502突变引起PPARγ启动子活性增强,不仅为阐述ONFH成脂成骨转分化障碍的分子机制提出了创新思路,也为ONFH人群的分子水平防治提出了潜在分子靶标。本研究结果提示,PPARγ启动子正常功能维持PPARγ成脂分化主调节器作用,主导BMSCs分化微环境及其主要靶分子的功能朝向成骨分化的方向,成脂分化受抑;而PPARγ基因启动子rs2920502突变(CC型)后,导致启动子活性亢进及PPARγ基因表达增强与功能紊乱,引起PPARγ主导BMSCs的分化微环境调控成骨及成脂分子开关的系统功能紊乱,改变BMSCs分化微环境的主导分化方向,使成骨分化障碍,成脂分化凸显,在环境因素影响下,股骨头局部骨髓腔脂肪组织渐进性蓄积,引起ONFH的发生发展。本研究结果率先解析了PPARγ启动子突变后引起ONFH BMSCs成脂与成骨转分化障碍,并通过其关键分子靶点引发与加重ONFH的脂肪蓄积,解析PPARγ启动子突变—调控分子谱异常—ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及关键分子靶点,为进一步用于ONFH的易感人群筛查及早期干预,促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接奠定了科学基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前14条
1 潘传燕;冯鹏霏;张永德;罗洪林;;尼罗罗非鱼PPARδ的原核表达及其多抗制备和纯化[J];福建农业学报;2019年09期
2 晏昆;蒙凌;陈玉芳;;PPARγ基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性研究[J];中国现代药物应用;2020年09期
3 Peng-Yue Mu;Chen-Chen Chu;Di Yu;Yan Shao;Shao-Zhen Zhao;;PPARγ: the dominant regulator among PPARs in dry eye lacrimal gland and diabetic lacrimal gland[J];International Journal of Ophthalmology;2020年06期
4 蒋天从;姚满红;郭璐莹;易建平;韩宝生;戚桂杰;刘英杰;张鸥;;PPARγ基因外显子6多态性与多囊卵巢综合征关系的系统评价[J];中国煤炭工业医学杂志;2016年12期
5 李晨波;张小娟;刘琴;刘丽;沈建芳;;血脂、PPARγ在子痫前期及子痫前期合并胎儿生长受限中的检测及意义[J];南通大学学报(医学版);2016年06期
6 Daniela Rigano;Carmina Sirignano;Orazio Taglialatela-Scafati;;The potential of natural products for targeting PPARα[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2017年04期
7 李腾;李琼;严国强;储佳佳;沈小丹;温见炳;黄起壬;钟荣梅;;人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定[J];南昌大学学报(医学版);2015年03期
8 陈强;李志满;吴建军;;BMSCs对大鼠放射性皮肤损伤的治疗研究[J];实验动物科学;2014年02期
9 胡亚;李东芳;;PPARγ在胃癌中作用的研究进展[J];中国中西医结合消化杂志;2014年05期
10 刘岩正;赵萤;赵红萍;王军慧;张旻;;持续及周期流体静压力对大鼠BMSCs增殖及凋亡的影响[J];中国美容医学;2014年13期
11 李强;党诚学;;PPARγ mRNA在胃癌组织中的表达及其与胃癌预后的关系[J];实用癌症杂志;2012年01期
12 刘洁琼;梅长林;熊锡山;贾洁爽;付莉莉;;酪氨酸激酶抑制剂对多囊肾病PPARγ的影响研究[J];中国中西医结合肾病杂志;2011年01期
13 何英;邬玉辉;;乳腺癌PPARγ和COX-2的表达及临床意义[J];中国现代医学杂志;2011年20期
14 张文信;刘金文;曹学伟;叶青合;;金匮肾气丸含药血清对体外兔BMSCs增殖细胞周期及凋亡的影响[J];辽宁中医杂志;2011年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 褚衍凯;黄佳新;李辉;王宁;;鸡PPARγ基因的转录后调控分析[A];2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2018年
2 谢岑;;Fatty acid sensor PPARα controlling bile acid metabolism[A];第三届中国生物物理学会代谢生物学分会学术研讨会论文集[C];2019年
3 汪昌宁;杨芳;胡英英;哈珊珊;;PPARγ在炎症和非炎症状态下对人牙周膜细胞成骨影响和机制探究[A];第十一次全国牙周病学学术会议摘要汇编[C];2017年
4 ;Genetic polymorphisms of PPAR-γ,HHEX,PTPRD,KCNQ1,and SRR affect therapeutic efficacy of Pioglitazone in Chinese Patients with type 2 diabetes[A];传承与发展,创湖南省生理科学事业的新高——湖南省生理科学会2011年度学术年会论文摘要汇编[C];2011年
5 陈刚;林新富;梁继兴;林丽香;沈晓丽;;过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因多态性与老年男性骨质疏松症相关性研究[A];2008中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编[C];2008年
6 ;Dynamic analysis and ligand binding affinity investigation of PPAR mutations[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年
7 邓悦;李才;赵贤俊;南征;;糖尿病大鼠肾脏PPARγmRNA表达及解毒通络保肾胶囊干预研究[A];第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编[C];2006年
8 王伟铭;章慧娣;刘峰;陈佳韵;陈楠;;PPARγ活化对肾间质成纤维细胞的作用研究[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年
9 陈刚;林新富;梁继兴;林丽香;沈晓丽;;过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因多态性与老年男性骨质疏松症相关性研究[A];2008内分泌代谢性疾病系列研讨会暨中青年英文论坛论文汇编[C];2008年
10 齐姗;;PPARγ在类风湿关节炎及其骨质疏松的临床研究[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李照彦;PPARγ启动子突变在股骨头坏死BMSCs成脂成骨转分化中的作用及其分子机制研究[D];吉林大学;2020年
2 张立岩;大豆异黄酮调控PPARγ信号通路治疗激素性股骨头坏死[D];中国人民解放军医学院;2016年
3 谢波;槲皮素调控PPARγ/NF-κB信号通路在心肌缺血再灌注中的保护作用及机制研究[D];上海交通大学;2016年
4 王晨超;PPARγ基因沉默在BMP2诱导的骨缺损修复中作用的研究[D];中国医科大学;2019年
5 刘磊;ANGPTL4介导PPARγ激活剂在子痫前期病理过程中的保护性作用[D];上海交通大学;2018年
6 周亚群;PPARγ激活缓解紫杉醇诱发大鼠神经病理性疼痛的机制研究[D];华中科技大学;2019年
7 张兆斯;PPARγ介导的平滑肌细胞表型转化在蛛网膜下腔出血中的作用及机制研究[D];重庆医科大学;2019年
8 李琪;USP29去泛素化并稳定Snail蛋白及Ajuba辅转录激活PPARγ和ERα转录活性的机制[D];上海交通大学;2018年
9 唐玉涛;间断PTH治疗对PMOP妇女循环MSCs的影响及促进BMSCs成骨分化的机制研究[D];天津医科大学;2019年
10 张美双;miR27a通过PPARγ调控脂肪细胞重编程诱导肥胖胰岛素抵抗的作用机制研究[D];吉林大学;2019年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张海兰;PPARγ基因过表达的大鼠BMSCs构建及老鹳草素调控成骨分化相关基因的作用研究[D];昆明医科大学;2019年
2 潘乐;补肾药对BMSCs成骨与成脂分化及β-catenin、PPARγ甲基化的影响[D];陕西中医学院;2014年
3 孙江森;BMSCs联合bFGF经髓芯减压移植治疗兔早期激素性股骨头坏死的研究[D];昆明医科大学;2012年
4 李志航;基于“髓枯骨痿”理论的探讨骨碎补对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的影响及临床应用[D];山东中医药大学;2018年
5 李娜;慢性不可预知温和应激通过HMGB1/TLR4下调PPARγ/LXRα/ABCA1促进ApoE~(-/-)小鼠的As病变[D];南华大学;2019年
6 刘琴琴;2型糖尿病的病理生理因素通过PPARγ-SKA1通路诱导中心体扩增[D];山西大学;2019年
7 薛碧宇;探究人BMSCs通过共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响[D];重庆医科大学;2019年
8 王久太;PPARγ途径改善妊娠期间睡眠剥夺子代认知功能的机制研究[D];电子科技大学;2019年
9 郑思思;BHBA、NEFAs对牛子宫内膜细胞中PPARs表达的影响[D];沈阳农业大学;2019年
10 胡航;PPARγ在鹅卵巢颗粒细胞脂质代谢中的功能研究[D];四川农业大学;2018年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 路人丙;PPAR激动剂梦断NASH[N];医药经济报;2020年
2 余志平;提升HDL水平 延控动脉硬化[N];中国医药报;2005年
3 ;美研究员意外发现癌症新疗法[N];福建科技报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978